DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2024.1509534
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39867886
تاريخ النشر: 2025-01-10
المؤلف: Qi Wu وآخرون
الموضوع الرئيسي: بروسيلا: التشخيص، الوبائيات، العلاج
نظرة عامة
تتناول ورقة البحث التحديات في تشخيص داء البروسيلات، وهو مرض حيواني مهم، بسبب قيود الطرق الحالية مثل الفحوصات المصلية وزراعة البكتيريا. لتعزيز دقة التشخيص، استخدم المؤلفون تحليل البروتينات باستخدام علامة الكتلة المتسلسلة (TMT) على كل من سلالة بروسيلة أبورتوس البرية DT21 وسلالة اللقاح B. abortus A19. حدد هذا التحليل 152 بروتينًا بمستويات تعبير عالية في السلالة البرية، تم التنبؤ من خلالها بـ 32 حبيبة خطية لبروتينات B باستخدام أدوات حسابية متنوعة. ثم تم دمج هذه الحبيبات لإنشاء بروتين اندماج متعدد الحبيبات، والذي تم التعبير عنه وتنقيته للاستخدام في اختبار المناعة المرتبط بالإنزيم غير المباشر (iELISA).
أظهر اختبار iELISA أداءً تشخيصيًا واعدًا، حيث حقق منطقة تحت منحنى التشغيل (AUC) قدرها 0.9576، مما يشير إلى حساسية وخصوصية عالية في اكتشاف داء البروسيلات البشري. على الرغم من هذه النتائج المشجعة، تعترف الدراسة بالقيود، بما في ذلك حجم العينة الصغير نسبيًا المكون من 100 عينة مصل إيجابية و96 سلبية، مما قد يؤثر على تعميم النتائج. يؤكد المؤلفون على أهمية المزيد من التحقق من خلال تجارب سريرية أكبر ومقارنات مع مجموعات التشخيص الحالية لتأكيد فعالية بروتين الاندماج متعدد الحبيبات كأنتيجين تشخيصي موثوق لداء البروسيلات.
مقدمة
داء البروسيلات، وهو مرض حيواني عالمي مهم يؤثر على أكثر من 170 دولة، يمثل تحديًا كبيرًا للصحة العامة مع تسجيل حوالي 500,000 حالة جديدة سنويًا. في الصين، زادت الحوادث بشكل ملحوظ، متجاوزة 70,400 حالة جديدة في عام 2023، ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى التنمية الاقتصادية وزيادة حركة الحيوانات ومنتجات الحيوانات. تستخدم الطرق التشخيصية الحالية، بما في ذلك الاختبارات المصلية مثل اختبار التكتل القياسي (SAT) واختبار التكتل باستخدام صفيحة الورد البنغالي (RBPT) واختبار المناعة المرتبط بالإنزيم (ELISA)، على نطاق واسع ولكن تواجه قيودًا مثل التفاعل المتبادل وتعقيد اختبار pathogenicity، مما يعيق تطبيقها العملي في إعدادات الرعاية الأولية.
ظهر دمج المعلوماتية الحيوية في البحث الطبي كأداة حاسمة لتقدم تصميم اللقاحات وفهم تفاعلات العائل والجراثيم. يسهل هذا النهج بين التخصصات تحديد الأنتيجينات المحتملة وتحسين مرشحي اللقاح من خلال تحليل البيانات الجينومية والبروتينية. تهدف الدراسة الحالية إلى معالجة التحديات التشخيصية لداء البروسيلات من خلال استخدام البروتيوميات والمعلوماتية الحيوية لتطوير بروتينات اندماج متعددة الحبيبات. من خلال فحص الحبيبات الأنتيجينية الرئيسية من سلالات بروسيلة الضارة ودمجها في بروتين واحد، تسعى الأبحاث إلى إنشاء أنتيجين تشخيصي جديد ذو خصوصية عالية، مما يسهل في النهاية تطوير اختبار ELISA غير المباشر (iELISA) لتشخيص داء البروسيلات البشري.
طرق
في هذه الدراسة، تم إجراء التحليلات الإحصائية باستخدام GraphPad Prism الإصدار 6.05، باستخدام تحليل النقاط البيانية وتحليل منحنى التشغيل (ROC) لتقييم البيانات. استخدم الباحثون تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) لتقييم الفروق بين المجموعات، إلى جانب اختبارات t لطلاب غير المقترنين للمقارنات بين مجموعتين. تم تحديد عتبة الدلالة عند p < 0.05، مما يشير إلى المعايير لتحديد النتائج ذات الدلالة الإحصائية.
نتائج
أظهرت نتائج تحليل iELISA أن كل من بروتين الاندماج والليبوبوليسكاريد (LPS) يظهران قدرات تشخيصية قوية، كما يتضح من مناطقهم تحت منحنى ROC (AUC). حقق بروتين الاندماج AUC قدره 0.9576 (95% CI، 0.9337-0.9814)، بينما وصل LPS إلى AUC قدره 0.9999 (95% CI، 0.9995-1.000). تشير هذه القيم إلى أن كلا الأنتيجينين فعالان للغاية لأغراض التشخيص.
باستخدام مؤشر يودن، تم تحديد القيمة المثلى لبروتين الاندماج لتكون 0.1970، مما أسفر عن حساسية قدرها 0.9300 (95% CI، 0.8611-0.9714) وخصوصية قدرها 0.8542 (95% CI، 0.7674-0.9179). بالمقابل، تم تحديد القيمة الحدية لـ LPS عند 0.1953، مما أسفر عن حساسية قدرها 0.9900 (95% CI، 0.9455-0.9997) وخصوصية مثالية قدرها 1.000 (95% CI، 0.9623-1.000). تم تفصيل هذه النتائج بشكل أكبر في الجدول 3، الشكل 2، والمواد التكميلية.
مناقشة
في هذه الدراسة، تم تطوير بروتين اندماج متعدد الحبيبات جديد كأنتيجين تشخيصي لداء البروسيلات، مستفيدًا من بروتيوميات TMT والمعلوماتية الحيوية لتعزيز الخصوصية وتقليل التفاعل المتبادل مقارنةً بالاختبارات التقليدية المعتمدة على LPS. استخدمت الأبحاث عينات مصل من 100 حالة إيجابية مؤكدة و96 حالة سلبية، إلى جانب عينات من مرضى مصابين بحمى من مسببات أمراض متنوعة، لتقييم فعالية بروتين الاندماج التشخيصية. حدد التحليل البروتيني 152 بروتينًا عالي التعبير في سلالة بروسيلة البرية، تم من خلالها التنبؤ بـ 32 حبيبة لبروتينات B باستخدام أدوات حسابية متعددة، مما أدى في النهاية إلى بناء بروتين الاندماج.
أشارت النتائج إلى أنه بينما أظهر بروتين الاندماج أداءً تشخيصيًا أقل قليلاً من LPS، إلا أنه أظهر تقليلًا كبيرًا في التفاعل المتبادل، خاصة مع عدوى الإشريكية القولونية. سلطت الدراسة الضوء على أهمية تحسين عملية التنقية لتعزيز الخصوصية بشكل أكبر. على الرغم من النتائج الواعدة، تم الاعتراف بالقيود مثل حجم العينة الصغير والحاجة إلى مزيد من التحقق ضد مجموعات متاحة تجاريًا. بشكل عام، تقدم هذه الأبحاث تقدمًا كبيرًا في تشخيص داء البروسيلات، مما يشير إلى أن بروتينات الاندماج متعددة الحبيبات يمكن أن تقدم بديلاً أكثر دقة وموثوقية للطرق الحالية. هناك حاجة إلى دراسات مستقبلية لاستكشاف المناعية لبروتين الاندماج في مجموعات سكانية متنوعة وتقييم أدائه في تجارب سريرية أكبر.
DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2024.1509534
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39867886
Publication Date: 2025-01-10
Author(s): Qi Wu et al.
Primary Topic: Brucella: diagnosis, epidemiology, treatment
Overview
The research paper addresses the challenges in diagnosing brucellosis, a significant zoonotic disease, due to the limitations of current methods like serological assays and bacterial cultures. To enhance diagnostic accuracy, the authors employed tandem mass tag (TMT) proteomic analysis on both the wild-type strain Brucella abortus DT21 and the vaccine strain B. abortus A19. This analysis identified 152 proteins with high expression levels in the wild-type strain, from which 32 B-cell linear epitopes were predicted using various computational tools. These epitopes were then concatenated to create a multiepitope fusion protein, which was expressed and purified for use in an indirect enzyme-linked immunosorbent assay (iELISA).
The iELISA demonstrated promising diagnostic performance, achieving an area under the receiver operating characteristic curve (AUC) of 0.9576, indicating high sensitivity and specificity for detecting human brucellosis. Despite these encouraging results, the study acknowledges limitations, including a relatively small sample size of 100 positive and 96 negative serum samples, which may affect the generalizability of the findings. The authors emphasize the importance of further validation through larger clinical trials and comparisons with existing diagnostic kits to confirm the efficacy of the multiepitope fusion protein as a reliable diagnostic antigen for brucellosis.
Introduction
Brucellosis, a significant global zoonosis affecting over 170 countries, presents a major public health challenge with approximately 500,000 new cases reported annually. In China, the incidence has notably increased, surpassing 70,400 new cases in 2023, largely due to economic development and increased movement of animals and animal products. Current diagnostic methods, including serological tests like the standard agglutination test (SAT), rose bengal plate agglutination test (RBPT), and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), are widely used but face limitations such as cross-reactivity and complexity in pathogenicity testing, hindering their practical application in primary care settings.
The integration of bioinformatics into biomedical research has emerged as a crucial tool for advancing vaccine design and understanding host-pathogen interactions. This interdisciplinary approach facilitates the identification of potential antigens and the optimization of vaccine candidates through the analysis of genomic and proteomic data. The current study aims to address the diagnostic challenges of brucellosis by employing proteomics and bioinformatics to develop multiepitope fusion proteins. By screening key antigenic epitopes from wild-virulent strains of Brucella and fusing them into a single protein, the research seeks to create a novel diagnostic antigen with high specificity, ultimately facilitating the development of an indirect ELISA (iELISA) for diagnosing human brucellosis.
Methods
In this study, statistical analyses were conducted using GraphPad Prism version 6.05, employing dot plot and receiver operating characteristic (ROC) curve analyses to evaluate the data. The researchers utilized one-way analysis of variance (ANOVA) to assess differences among groups, alongside unpaired Student’s t-tests for comparisons between two groups. A significance threshold was set at p < 0.05, indicating the criteria for determining statistically significant results.
Results
The results of the iELISA analysis demonstrated that both the fusion protein and lipopolysaccharide (LPS) exhibit strong diagnostic capabilities, as indicated by their respective areas under the ROC curve (AUC). The fusion protein achieved an AUC of 0.9576 (95% CI, 0.9337-0.9814), while LPS reached an AUC of 0.9999 (95% CI, 0.9995-1.000). These values suggest that both antigens are highly effective for diagnostic purposes.
Using the Youden index, the optimal cutoff value for the fusion protein was determined to be 0.1970, yielding a sensitivity of 0.9300 (95% CI, 0.8611-0.9714) and a specificity of 0.8542 (95% CI, 0.7674-0.9179). In contrast, the cutoff value for LPS was set at 0.1953, which resulted in a sensitivity of 0.9900 (95% CI, 0.9455-0.9997) and a perfect specificity of 1.000 (95% CI, 0.9623-1.000). These findings are further detailed in Table 3, Figure 2, and the Supplementary Material.
Discussion
In this study, a novel multiepitope fusion protein was developed as a diagnostic antigen for brucellosis, leveraging TMT proteomics and bioinformatics to enhance specificity and reduce cross-reactivity compared to traditional LPS-based assays. The research utilized serum samples from 100 confirmed positive and 96 negative cases, alongside samples from febrile patients infected with various pathogens, to evaluate the fusion protein’s diagnostic efficacy. The proteomic analysis identified 152 highly expressed proteins in the wild-type Brucella strain, from which 32 B-cell epitopes were predicted using multiple computational tools, ultimately leading to the construction of the fusion protein.
The findings indicated that while the fusion protein exhibited slightly lower diagnostic performance than LPS, it demonstrated significantly reduced cross-reactivity, particularly with Escherichia coli infections. The study highlighted the importance of refining the purification process to further enhance specificity. Despite the promising results, limitations such as the small sample size and the need for further validation against commercially available kits were acknowledged. Overall, this research presents a significant advancement in brucellosis diagnostics, suggesting that multiepitope fusion proteins could offer a more accurate and reliable alternative to existing methods. Future studies are warranted to explore the immunogenicity of the fusion protein in diverse populations and to assess its performance in larger clinical trials.