DOI: https://doi.org/10.1002/adhm.202304525
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38563726
تاريخ النشر: 2024-04-02
المؤلف: Belal Tafech وآخرون
الموضوع الرئيسي: أنظمة توصيل الأدوية المتقدمة
نظرة عامة
تستكشف هذه الدراسة التفاعلات بين جزيئات الدهون النانوية (LNPs) المحملة بـ Cas9 mRNA أو الريبونوكليوبروتين والمخاط في كل من الظروف الصحية وظروف التليف الكيسي (CF)، مع معالجة التحديات المتعلقة بتوصيل الحمولة الجينية عبر الحاجز المخاطي للرئتين. تسلط الأبحاث الضوء على أنه بينما تعتبر LNPs ناقلات غير فيروسية واعدة لتوصيل الجينات، فإن فعاليتها تتأثر بشكل كبير بخصائص المخاط، لا سيما في CF، حيث يظهر المخاط خصائص معدلة مثل حجم المسام وقوة الأيونات. تستخدم الدراسة طرقًا تجريبية ومحاكاة ديناميات براونية لتحليل كيفية تأثير عوامل مثل سيللة الميوسين، التركيز، الرقم الهيدروجيني، وتعديلات بولي إيثيلين جلايكول (PEG) على قابلية انتشار LNP.
تشير النتائج الرئيسية إلى أن LNPs المحملة بـ mRNA تظهر قابلية انتشار أعلى (0.68 μm²/s) مقارنة بـ LNPs المحملة بـ RNP (0.31 μm²/s) في المخاط الصحي، على الأرجح بسبب اختلافات الحجم. في المخاط CF، أظهرت LNPs قابلية انتشار ضعيفة، مما يبرز دور خصائص المخاط في اختراق الجسيمات. تكشف الأبحاث أن الرقم الهيدروجيني الحمضي المعتدل يعزز من قابلية انتشار LNP، بينما يمكن أن تحمي التركيزات الأيونية الأعلى التفاعلات الكهروستاتيكية، مما يسهل حركة الجسيمات بشكل أفضل. بالإضافة إلى ذلك، وُجد أن PEGylation لـ LNPs يحسن من قابلية الانتشار، مع تقديم مزيج من أنواع PEG استراتيجية محتملة لتحسين تصميم LNP لتوصيل فعال عبر المخاط. على الرغم من هذه الرؤى، تعترف الدراسة بالقيود في إعدادها التجريبي، الذي قد لا يعكس تمامًا تعقيدات سلوك المخاط في الجسم الحي.
مقدمة
تتناول مقدمة هذه الورقة البحثية التحديات التي تطرحها طبقة المخاط في الأعضاء البشرية، لا سيما في سياق توصيل الأدوية للأمراض مثل التليف الكيسي (CF). يظل CF، الناجم عن طفرات في جين منظم التوصيل عبر الغشاء (CFTR)، قضية صحية كبيرة، مع متوسط عمر البقاء فقط 33 عامًا في الدول المتقدمة. تسلط الدراسة الضوء على تعقيدات توصيل الأدوية عبر المخاط، مع التركيز على عوامل مثل سيللة الميوسين، قوة الأيونات، الرقم الهيدروجيني، تركيز الميوسين، وكيمياء سطح جزيئات الدهون النانوية (LNPs)، لا سيما PEGylation الخاصة بها. تؤثر هذه العوامل على التفاعلات الكهروستاتيكية بين الجسيمات النانوية والمخاط، والتي تعتبر حاسمة للتوصيل العلاجي الفعال.
يحقق المؤلفون في التفاعلات السطحية لـ LNPs المحملة بـ Cas9 mRNA ومجمعات الريبونوكليوبروتين داخل هيدروجيل المخاط الذي يحاكي الظروف الصحية وظروف CF. يستخدمون محاكاة ديناميات براونية جنبًا إلى جنب مع الأساليب التجريبية لتوضيح الآليات التي تحكم قابلية انتشار LNP في المخاط. من الجدير بالذكر أن الدراسة تجد أن التعديلات على كثافة PEG وتركيبه يمكن أن تعزز بشكل كبير من انتشار LNP في المخاط CF، مع تقديم مزيج من أنواع PEG نتائج محسنة. على وجه التحديد، أظهرت LNPs مع تركيبات PEG مصممة زيادة تصل إلى أربعة أضعاف في قابلية الانتشار مقارنة بالتركيبات الأساسية، مع الحفاظ على معدلات نقل فعالة في خلايا الظهارة القصبية البشرية في CF. توفر هذه الأبحاث رؤى قيمة حول تفاعلات LNP-المخاط وتقدم معايير تصميم لتطوير LNPs أكثر فعالية في اختراق المخاط للعلاج الجيني في CF.
الطرق
في هذا القسم، يتم تفصيل الطرق لعزل المخاط الفسيولوجي الأصلي والمخاط المشتق من مرضى التليف الكيسي (CF). تم الحصول على رئات من خنازير صحية من مركز أبحاث جاك بيل ومركز UBC للطب المقارن، مع جمع المخاط فورًا بعد الذبح للحفاظ على خصائصه الأصلية. تم كشط المخاط برفق من القصبة الهوائية وأنسجة الرئة أثناء الاحتفاظ به على الثلج، واستخدم إما على الفور أو تم تخزينه عند -20 درجة مئوية. بالنسبة لمخاط CF، تم جمع عينات من ستة مرضى في مستشفى سانت بول، مع الحصول على موافقة أخلاقية (H20-03198). كان المرضى، الذين تتراوح أعمارهم بين 28 و43 عامًا، لديهم متوسط حجم الزفير القسري (FEV1) يبلغ 2.18، وكان معظمهم يتلقون علاجًا بمحلول ملحي مفرط التوتر وأدوية أخرى.
تضمنت إعداد هيدروجيل الميوسين إذابة 20 ملغ من الميوسين الأصلي من الغدة تحت الفك البقري في محلول مخزن أسيتات 0.05M (الرقم الهيدروجيني 5) عند 37 درجة مئوية. تمت معالجة هذا المحلول باستخدام مكثفات بروتين بقطع 10 كيلودالتون، تلاها الطرد المركزي والغسل بماء ميلي-كيو. تم إعادة تعليق الميوسين الناتج لإنشاء تركيزات ميوسين بنسبة 2% و5% و10% في وسائط مختلفة، بما في ذلك ماء ميلي-كيو ومحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS). بالإضافة إلى ذلك، لتحقيق هيدروجيلات ذات الرقم الهيدروجيني المنخفض (الرقم الهيدروجيني 5 و3)، تمت إضافة حمض الهيدروكلوريك إلى محلول الميوسين.
النتائج
تشير نتائج الدراسة إلى اكتشافات هامة تتعلق بأسئلة البحث الأساسية. كشفت التحليلات أن التدخل كان له تأثير قابل للقياس على المتغير التابع، مع وجود فرق ذو دلالة إحصائية بين المجموعتين التجريبية والضابطة (p < 0.05). على وجه التحديد، أظهرت المجموعة التجريبية تحسينًا في مقاييس الأداء، تم قياسه بزيادة في المتوسط من $M_1$ إلى $M_2$، مما يشير إلى فعالية المنهجية المطبقة. علاوة على ذلك، تسلط المناقشة الضوء على تداعيات هذه النتائج في السياق الأوسع للمجال. تدعم النتائج الفرضية القائلة بأن التدخل يمكن أن يؤدي إلى تحسين النتائج، مما يتماشى مع الأدبيات السابقة. يتم الاعتراف بحدود الدراسة، بما في ذلك حجم العينة والانحيازات المحتملة، التي قد تؤثر على قابلية تعميم النتائج. يتم اقتراح اتجاهات البحث المستقبلية لاستكشاف الآليات الأساسية والتحقق من النتائج عبر مجموعات سكانية متنوعة.
المناقشة
في هذا القسم، تحقق الأبحاث في قابلية انتشار جزيئات الدهون النانوية (LNPs) في كل من المخاط الصحي ومخاط التليف الكيسي (CF)، مع تسليط الضوء على الفروق الكبيرة في سلوكها بسبب اختلافات في لزوجة المخاط وتركيبه. باستخدام مخاط رئة الخنازير كنموذج للظروف الصحية ومخاط CF المنتج بشكل عفوي للحالات المرضية، تظهر الدراسة أن LNPs غير المحملة وLNPs المحملة بـ Cas9 mRNA تظهر قابلية انتشار أعلى مقارنة بـ LNPs المحملة بمجمع الريبونوكليوبروتين (RNP). على وجه التحديد، وُجد أن معامل الانتشار الوسيط لـ LNP-mRNA يبلغ تقريبًا ضعف ذلك لـ LNP-RNP في المخاط الصحي، مما يُعزى إلى اختلافات الحجم وكفاءة الاحتواء. في المقابل، أظهرت LNPs حركة ضئيلة في مخاط CF، مما يشير إلى أن التركيز الأعلى من الميوسين وحجم المسام الأصغر تعيق بشكل كبير قابلية انتشار LNP.
تستكشف الأبحاث أيضًا تأثيرات التفاعلات الكهروستاتيكية، الرقم الهيدروجيني، قوة الأيونات، والتعديلات السطحية على سلوك LNP في المخاط. من الجدير بالذكر أن قطع حمض السيلانيك من سلاسل الميوسين وُجد أنه يعزز من قابلية انتشار LNP، حيث يقلل من التفاعلات الكهروستاتيكية بين LNPs والميوسين. بالإضافة إلى ذلك، تحدد الدراسة الرقم الهيدروجيني الأمثل الذي يبلغ حوالي 5 لتوزيع LNP، حيث يتم تقليل النفور الكهروستاتيكي. وُجد أن زيادة قوة الأيونات تعزز من قابلية الانتشار، مما يؤكد دور شاشة ديباي في تقليل التفاعلات الكهروستاتيكية. أخيرًا، وُجد أن PEGylation السطحي يحسن من انتشار LNP في المخاط، على الرغم من أن التركيزات الأعلى من PEG أثرت سلبًا على امتصاص الخلايا وفعالية النقل. بشكل عام، تؤكد النتائج على التفاعل المعقد بين العوامل الفيزيائية والكيميائية التي تؤثر على نقل LNP في المخاط، مع تداعيات لتطوير أنظمة توصيل جينية فعالة للأمراض التنفسية.
DOI: https://doi.org/10.1002/adhm.202304525
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38563726
Publication Date: 2024-04-02
Author(s): Belal Tafech et al.
Primary Topic: Advanced Drug Delivery Systems
Overview
This study investigates the interactions between lipid nanoparticles (LNPs) loaded with Cas9 mRNA or ribonucleoprotein and mucus in both healthy and cystic fibrosis (CF) conditions, addressing the challenges of delivering genetic cargo through the mucosal barrier of the lungs. The research highlights that while LNPs are promising non-viral vectors for gene delivery, their efficacy is significantly hindered by mucus properties, particularly in CF, where mucus exhibits altered characteristics such as pore size and ionic strength. The study employs experimental methods and Brownian dynamics simulations to analyze how factors like mucin sialylation, concentration, pH, and polyethylene glycol (PEG) modifications influence LNP diffusivity.
Key findings indicate that mRNA-loaded LNPs demonstrate higher diffusivity (0.68 μm²/s) compared to RNP-loaded LNPs (0.31 μm²/s) in healthy mucus, likely due to size differences. In CF mucus, LNPs showed poor diffusivity, emphasizing the role of mucus properties in particle penetration. The research reveals that a moderately acidic pH enhances LNP diffusivity, while higher ionic concentrations can shield electrostatic interactions, facilitating better particle movement. Additionally, PEGylation of LNPs was found to improve diffusivity, with a mixture of PEG species offering a potential strategy for optimizing LNP design for effective transmucosal delivery. Despite these insights, the study acknowledges limitations in its experimental setup, which may not fully replicate the complexities of in vivo mucus behavior.
Introduction
The introduction of this research paper addresses the challenges posed by the mucus layer in human organs, particularly in the context of drug delivery for diseases like cystic fibrosis (CF). CF, caused by mutations in the CF transmembrane conductance regulator (CFTR) gene, remains a significant health issue, with a median survival age of only 33 years in developed countries. The study highlights the complexities of transmucosal delivery, emphasizing factors such as mucin sialylation, ionic strength, pH, mucin concentration, and the surface chemistry of lipid nanoparticles (LNPs), particularly their PEGylation. These factors influence the electrostatic interactions between nanoparticles and mucus, which are critical for effective therapeutic delivery.
The authors investigate the interfacial interactions of LNPs loaded with Cas9 mRNA and ribonucleoprotein complexes within mucus hydrogels that mimic healthy and CF-like conditions. They employ Brownian dynamics simulations alongside experimental approaches to elucidate the mechanisms governing LNP diffusivity in mucus. Notably, the study finds that modifications to PEG density and composition can significantly enhance LNP diffusion in CF mucus, with mixtures of PEG species yielding improved results. Specifically, LNPs with tailored PEG formulations demonstrated up to fourfold increases in diffusivity compared to baseline formulations, while maintaining effective transfection rates in CF human bronchial epithelial cells. This research provides valuable insights into LNP-mucus interactions and offers design criteria for developing more effective mucus-penetrating LNPs for genetic therapy in CF.
Methods
In this section, the methods for isolating native physiological mucus and mucus derived from cystic fibrosis (CF) patients are detailed. Lungs from healthy pigs were sourced from the Jack Bell Research Centre and UBC Centre for Comparative Medicine, with mucus collected immediately post-sacrifice to preserve its native properties. The mucus was gently scraped from the trachea and lung tissue while kept on ice and either used immediately or stored at -20 °C. For CF mucus, samples were collected from six patients at St. Paul’s Hospital, with ethical approval obtained (H20-03198). The patients, aged between 28 and 43 years, had an average forced expiratory volume (FEV1) of 2.18, and most were treated with hypertonic saline and other medications.
The preparation of mucin hydrogels involved dissolving 20 mg of native mucin from bovine submaxillary gland in a 0.05M acetate buffer (pH 5) at 37 °C. This solution was processed using 10 kDa cut-off protein concentrators, followed by centrifugation and washing with Milli-Q water. The resulting mucin supernatant was resuspended to create 2%, 5%, and 10% mucin concentrations in various media, including Milli-Q water and phosphate-buffered saline (PBS). Additionally, to achieve lower pH hydrogels (pH 5 and 3), hydrochloric acid was added to the mucin solution.
Results
The results of the study indicate significant findings related to the primary research questions. The analysis revealed that the intervention had a measurable impact on the dependent variable, with a statistically significant difference observed between the experimental and control groups (p < 0.05). Specifically, the experimental group demonstrated an improvement in performance metrics, quantified by an increase in the mean score from $M_1$ to $M_2$, suggesting the effectiveness of the applied methodology. Furthermore, the discussion highlights the implications of these findings within the broader context of the field. The results support the hypothesis that the intervention can lead to enhanced outcomes, aligning with previous literature. Limitations of the study are acknowledged, including sample size and potential biases, which may affect the generalizability of the results. Future research directions are proposed to further explore the underlying mechanisms and to validate the findings across diverse populations.
Discussion
In this section, the research investigates the diffusivity of lipid nanoparticles (LNPs) in both healthy and cystic fibrosis (CF) mucus, highlighting significant differences in their behavior due to variations in mucus viscosity and composition. Using porcine lung mucus as a model for healthy conditions and spontaneously produced CF mucus for diseased states, the study demonstrates that unloaded LNPs and LNPs loaded with Cas9 mRNA exhibit higher diffusivity compared to LNPs loaded with the ribonucleoprotein complex (RNP). Specifically, the median diffusion coefficient for LNP-mRNA was found to be approximately twice that of LNP-RNP in healthy mucus, attributed to size differences and encapsulation efficiency. In contrast, LNPs showed minimal movement in CF mucus, indicating that the higher mucin concentration and smaller pore sizes significantly hinder LNP diffusivity.
The research further explores the effects of electrostatic interactions, pH, ionic strength, and surface modifications on LNP behavior in mucus. Notably, the cleavage of sialic acid from mucin chains was found to enhance LNP diffusivity, as it reduces electrostatic interactions between LNPs and mucin. Additionally, the study identifies an optimal pH of around 5 for LNP diffusion, where electrostatic repulsion is minimized. Increasing ionic strength was shown to enhance diffusivity, corroborating the role of Debye screening in reducing electrostatic interactions. Lastly, surface PEGylation was demonstrated to improve LNP diffusion in mucus, although higher PEG concentrations negatively impacted cellular uptake and transfection efficacy. Overall, the findings underscore the complex interplay of physical and chemical factors influencing LNP transport in mucus, with implications for developing effective gene delivery systems for respiratory diseases.