DOI: https://doi.org/10.1038/s42004-025-01662-4
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40849515
تاريخ النشر: 2025-08-23
المؤلف: Tomohiro Yoshinari وآخرون
الموضوع الرئيسي: هيكل الإنزيم ووظيفته
نظرة عامة
تركز الأبحاث على جين السرطان الفيروسي المتماثل مع KRAS، وهو جين سرطاني متحور بشكل متكرر في أنواع مختلفة من السرطانات، مع تسليط الضوء بشكل خاص على طفرة KRAS(G12D)، التي تعد الأكثر انتشارًا. بينما تم تطوير والتحقق من عدة مثبطات تساهمية تستهدف طفرة KRAS(G12C)، لم يتم الموافقة على أي علاجات لغيرها من الطفرات، بما في ذلك G12D. تقدم هذه الدراسة ASP3082، وهو مُفكك انتقائي لـ KRAS(G12D)، وتعرض التركيب البلوري للمجمع الثلاثي الناتج عن الدواء والذي يتضمن KRAS(G12D) وASP3082 وبروتين فون هيبل-لينداو (VHL).
لقد أظهر ASP3082 فعالية في تحفيز تحلل بروتين KRAS(G12D) مع انتقائية ملحوظة، حيث أظهر نشاطًا دوائيًا قويًا وعزز انكماش الورم في نماذج زراعة مختلفة تحتوي على طفرة KRAS(G12D). تشير النتائج إلى أن ASP3082 يحمل وعدًا كعامل علاجي للسرطانات المدفوعة بطفرة KRAS(G12D) وهو حاليًا قيد التحقيق السريري. بالإضافة إلى ذلك، تحدد الدراسة استراتيجية تحسين قائمة على التركيب قد تكون قابلة للتطبيق لتعزيز أدوية أخرى ثنائية الوظيفة تحفز القرب.
طرق
في هذه الدراسة، تم التعبير عن وتنقية بروتينات مختلفة متورطة في إشارات KRAS باستخدام ناقلات بلازميد وسلالات بكتيرية مختلفة. تم استنساخ KRAS (G12D، 1-169) في ناقل pET-30 مع علامة His6 في الطرف N، بينما تم استنساخ SOS (564-1049) وVHL (54-213) في pET-28 مع علامات مماثلة. تم التعبير عن RAF1 (cRAF) كبروتين اندماجي GST باستخدام ناقل pGEX-2T. تم تحفيز التعبير البروتيني في الإشريكية القولونية BL21 (DE3) باستخدام الإيزوبروبيلي-β-D-ثيوغالاكتوزيد (IPTG)، تلا ذلك التحلل، الطرد المركزي، والتنقية من خلال تقنيات كروماتوغرافيا مختلفة، بما في ذلك Ni-NTA Superflow وكروماتوغرافيا الفصل حسب الحجم (SEC). كانت بروتوكولات التنقية تختلف قليلاً لكل بروتين، مع ظروف محددة لقطع العلامة وتركيبات العازلات مصممة لتحسين العائد والنقاء.
تم تحقيق بلورة KRAS (G12D) في مجمع مع المركب 1 باستخدام طرق الانتشار البخاري القائم على القطرات الثابتة، وتم جمع بيانات حيود الأشعة السينية للتحليل الهيكلي. تم أيضًا بلورة المجمع الثلاثي لـ KRAS وVCB وASP3082 تحت ظروف مماثلة. تم إجراء نمذجة جزيئية للمجمع الثلاثي باستخدام برنامج Maestro، مع بحث عن التشكيلات لتوليد نماذج معقولة. بالإضافة إلى ذلك، تم إجراء تحليل جهاز استشعار الرنين السطحي (SPR) لدراسة تفاعلات Avi-KRAS (G12D) الموصوفة بالبيوتين مع المركبات الاختبارية، مما يوفر رؤى حول ديناميات الربط والأفكار المتعلقة بتفاعلات البروتين-الليغاند.
النتائج
في هذا القسم، يبلغ المؤلفون عن الحصول الناجح على رابط ملكية لـ KRAS(G12D) وتطوير مُفككات ثنائية الوظيفة تستهدف هذا البروتين. في البداية، حددوا رابطًا مناسبًا لـ KRAS(G12D) (المركب 1) من خلال التصميم القائم على التركيب، مستفيدين من رابطهم الحالي لـ KRAS(G12C)، ASP2453. تم حل التركيب البلوري لمجمع KRAS(G12D) المرتبط بـ GDP مع المركب 1 (رمز PDB: 9L6A)، كاشفًا عن تفاعلات حاسمة، لا سيما بين الأمين المربوط للمركب 1 وبقايا Asp12 من بروتين KRAS(G12D)، مع مسافة تبلغ 2.78 Å.
بعد تحديد الرابط، قام الباحثون بتخليق مكتبة من المُفككات الثنائية الوظيفة (حوالي 30 مركبًا) من خلال دمج رابط KRAS(G12D) مع مختلف الليغاندات E3 والموصلات القصيرة، حيث كانت مواقع ارتباط الموصلات معرضة للمذيب. من بين هذه، أظهر المركب 2، الذي يستخدم VHL كليغاز E3، نشاط تحلل معتدل لـ KRAS(G12D) في اختبارات المناعية على خلايا السرطان المتحورة بـ KRAS(G12D) (AsPC-1) بعد 24 ساعة من العلاج، مع تركيز فعال حوالي 1 ميكرومتر. تشير هذه النتيجة إلى تحديد مُفكك واعد يشبه الدواء مع جزء موصل قصير جدًا.
المناقشة
في هذا القسم، يناقش المؤلفون تطوير وتحسين مُفكك جديد لـ KRAS(G12D)، ASP3082، من خلال نهج قائم على التركيب. في البداية، واجهوا تحديات في بلورة المجمع الثلاثي لـ KRAS(G12D)/المفكك 2/VHL، مما دفعهم لاستخدام النمذجة الحاسوبية لبناء مجمع ثلاثي معقول. نجح المؤلفون في توليد عدة تشكيلات من المفكك وحددوا تفاعلات رئيسية يمكن تحسينها لتعزيز استقرار المجمع الثلاثي. من الجدير بالذكر أن التعديلات على الليغاند VHL، مثل إزالة مجموعة ميثيل وإدخال مجموعة هيدروكسيل، حسنت بشكل كبير من نشاط التحلل والألفة الثلاثية للمفكك.
أدى التحسين إلى ASP3082، الذي أظهر تحللًا قويًا لـ KRAS(G12D) مع DC50 يبلغ 38 نانومتر وأظهر تثبيطًا انتقائيًا لإشارات KRAS في خطوط خلايا السرطان المختلفة. من المهم أن ASP3082 أظهر تثبيطًا دائمًا لإشارات KRAS، مما يتناقض مع المثبطات التقليدية التي أدت إلى إعادة تنشيط التغذية الراجعة للمسار. أكدت الدراسات الحية فعالية ASP3082 المضادة للورم في نماذج الزراعة، مما يبرز إمكانيته كعلاج مستهدف للسرطانات المتحورة بـ KRAS(G12D). بشكل عام، تؤكد النتائج فعالية نهج التصميم العقلاني في تطوير مُفكك انتقائي وقوي لهدف سرطاني صعب.
DOI: https://doi.org/10.1038/s42004-025-01662-4
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40849515
Publication Date: 2025-08-23
Author(s): Tomohiro Yoshinari et al.
Primary Topic: Enzyme Structure and Function
Overview
The research focuses on the Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog (KRAS), a frequently mutated oncogene in various cancers, particularly highlighting the KRAS(G12D) mutation, which is the most prevalent. While several covalent inhibitors targeting the KRAS(G12C) mutation have been developed and validated, no treatments have been approved for other mutations, including G12D. This study introduces ASP3082, a selective degrader for KRAS(G12D), and presents the crystal structure of the drug-induced ternary complex involving KRAS(G12D), ASP3082, and von Hippel-Lindau (VHL) protein.
ASP3082 has been shown to effectively induce degradation of the KRAS(G12D) protein with notable selectivity, exhibiting strong pharmacological activity and promoting tumor regression in various xenograft models harboring the KRAS(G12D) mutation. The findings suggest that ASP3082 holds promise as a therapeutic agent for cancers driven by the KRAS(G12D) mutation and is currently undergoing clinical investigation. Additionally, the study outlines a structure-based rational optimization strategy that may be applicable for enhancing other bifunctional proximity-inducing drugs.
Methods
In this study, various proteins involved in KRAS signaling were expressed and purified using different plasmid vectors and bacterial strains. KRAS (G12D, 1-169) was cloned into the pET-30 vector with an N-terminal His6 tag, while SOS (564-1049) and VHL (54-213) were cloned into pET-28 with similar tags. RAF1 (cRAF) was expressed as a GST fusion protein using the pGEX-2T vector. Protein expression was induced in Escherichia coli BL21 (DE3) with isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG), followed by lysis, centrifugation, and purification through various chromatography techniques, including Ni-NTA Superflow and size-exclusion chromatography (SEC). The purification protocols varied slightly for each protein, with specific conditions for tag cleavage and buffer compositions tailored to optimize yield and purity.
Crystallization of KRAS (G12D) in complex with compound 1 was achieved using sitting-drop vapor diffusion methods, and X-ray diffraction data were collected for structural analysis. The ternary complex of KRAS, VCB, and ASP3082 was also crystallized under similar conditions. Molecular modeling of the ternary complex was performed using Maestro software, with conformational searches to generate plausible models. Additionally, surface plasmon resonance (SPR) biosensor analysis was conducted to study the interactions of biotinylated Avi-KRAS (G12D) with test compounds, providing insights into the binding dynamics and affinities of the protein-ligand interactions.
Results
In this section, the authors report the successful acquisition of a proprietary binder for KRAS(G12D) and the development of bifunctional degraders targeting this protein. Initially, they identified a suitable KRAS(G12D) binder (compound 1) through structure-based design, leveraging their existing KRAS(G12C) binder, ASP2453. The crystal structure of the GDP-bound KRAS(G12D) complexed with compound 1 was solved (PDB code: 9L6A), revealing critical interactions, particularly between the bridged amine of compound 1 and the Asp12 residue of the KRAS(G12D) protein, with a distance of 2.78 Å.
Following the identification of the binder, the researchers synthesized a library of bifunctional degraders (approximately 30 compounds) by combining the KRAS(G12D) binder with various E3 ligands and short linkers, as the linker attachment sites were solvent-exposed. Among these, compound 2, which utilizes VHL as the E3 ligase, demonstrated moderate KRAS(G12D) degradation activity in immunoblot assays on KRAS(G12D)-mutated cancer cells (AsPC-1) after 24 hours of treatment, with an effective concentration around 1 μM. This finding marks the identification of a promising drug-like hit degrader with a very short linker moiety.
Discussion
In this section, the authors discuss the development and optimization of a novel KRAS(G12D) degrader, ASP3082, through a structure-based approach. Initially, they faced challenges in crystallizing the ternary complex of KRAS(G12D)/degrader 2/VHL, prompting the use of in-silico modeling to construct a plausible ternary complex. The authors successfully generated multiple conformations of the degrader and identified key interactions that could be optimized to enhance ternary complex stability. Notably, modifications to the VHL ligand, such as removing a methyl group and introducing a hydroxyl group, significantly improved the degradation activity and ternary affinity of the degrader.
The optimization led to ASP3082, which demonstrated potent degradation of KRAS(G12D) with a DC50 of 38 nM and showed selective inhibition of KRAS-dependent signaling in various cancer cell lines. Importantly, ASP3082 exhibited durable inhibition of KRAS signaling, contrasting with traditional inhibitors that led to feedback reactivation of the pathway. In vivo studies confirmed the anti-tumor efficacy of ASP3082 in xenograft models, showcasing its potential as a targeted therapy for KRAS(G12D)-mutated cancers. Overall, the findings underscore the effectiveness of a rational design approach in developing a selective and potent degrader for a challenging oncogenic target.