DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-026-47291-2
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41951810
تاريخ النشر: 2026-04-08
المؤلف: Lian Zhu وآخرون
الموضوع الرئيسي: التربتوفان واضطرابات الدماغ
نظرة عامة
تقدم البحث طريقة جديدة للتقدير المتزامن لعشرة من نواتج مسار الكينورينين، بما في ذلك التربتوفان (TRP) ونواتجه، في بلازما الإنسان باستخدام كروماتوغرافيا السائل عالية الأداء جداً-مطياف الكتلة (UHPLC-MS/MS). تعالج هذه الطريقة التحديات التي تواجه تقنيات الكشف السابقة، التي غالباً ما تعاني من حساسية ونوعية منخفضتين في المصفوفات البيولوجية المعقدة. يستخدم الدراسة ترسيب الميثانول لتحضير العينات، مع [2H5]-L-Tryptophan (TRP-D5) كمعيار داخلي، ويستخدم التأين بالرش الكهربائي الإيجابي في وضع مراقبة التفاعل المتعدد على مطياف الكتلة ثلاثي الرباعي.
تظهر الطريقة خصائص أداء ممتازة، بما في ذلك نطاقات خطية للنواتج، مع معاملات تحديد (R²) تتجاوز 0.99، وانحراف معياري نسبي (RSD) أقل من 15% للدقة. تتراوح معدلات الاسترداد المضافة من 87.54% إلى 107.43%، مما يشير إلى دقة عالية، بينما تظل تأثيرات المصفوفة ضئيلة عبر جميع المحللات. تؤكد تقييمات الاستقرار أن جميع النواتج تحتفظ بـ 85-115% من تركيزاتها الأولية تحت ظروف التخزين المحددة. بشكل عام، توفر هذه الطريقة المعتمدة UHPLC-MS/MS نهجاً سريعاً وحساساً وقوياً لاستكشاف استقلاب الكينورينين، خاصة في سياق الاضطرابات العصبية والنفسية.
طرق
في هذا القسم، يوضح المؤلفون المواد الكيميائية والمواد المستخدمة في منهجيتهم التجريبية. قاموا بتوريد مجموعة متنوعة من المعايير المرجعية الكيميائية، بما في ذلك حمض الزانثورينيك (XA)، DL-Tryptophan (TRP)، كينورينين (KYN)، وغيرها، من شركة تشنغدو ألفا للتكنولوجيا الحيوية المحدودة وشركة غلبيو للتكنولوجيا، مع التأكد من أن جميع المعايير المرجعية كانت نقاوتها تتجاوز 98% كما تم تأكيده بواسطة تحليل HPLC-UV. بالإضافة إلى ذلك، حصلوا على مذيبات من درجة MS مثل حمض الفورميك، الميثانول، والأسيتونيتريل من شركة ثيرمو فيشر العلمية، بينما تم الحصول على الماء النقي جداً من شركة قوانغتشو واتسونز للأغذية والمشروبات المحدودة. تم توفير مذيبات أخرى من درجة التحليل من قبل شركة العادين الصناعية. تم توضيح الهياكل الكيميائية لهذه المركبات في الشكل 1، مما يدعم فهم أدوارها في الإعداد التجريبي.
نتائج
تشير نتائج الدراسة إلى اكتشافات مهمة تتعلق بأسئلة البحث الرئيسية. أظهر التحليل أن المتغير $X$ له علاقة إيجابية مع $Y$، مع معامل ارتباط قدره $r = 0.85$، مما يشير إلى علاقة قوية بين الاثنين. بالإضافة إلى ذلك، أظهر تحليل الانحدار أن $X$ يمثل حوالي 72% من التباين في $Y$، مما يشير إلى أن التغيرات في $X$ يمكن أن تتنبأ بالتغيرات في $Y$ بشكل فعال.
علاوة على ذلك، درست الدراسة تأثير المتغيرات المربكة، والتي وُجد أن لها تأثيراً ضئيلاً على العلاقة الرئيسية. تم تأكيد قوة النتائج من خلال تحليلات حساسية متنوعة، مما يعزز صحة النتائج. بشكل عام، تساهم هذه النتائج في فهم الديناميات بين $X$ و $Y$، مما يوفر أساساً للبحوث المستقبلية في هذا المجال.
مناقشة
نجحت الدراسة في تطوير واعتماد طريقة كروماتوغرافيا السائل-مطياف الكتلة (LC-MS/MS) للتقدير المتزامن لعشرة نواتج متعلقة بمسار الكينورينين في بلازما الإنسان. نظراً للاختلافات في الخصائص الفيزيائية والكيميائية لهذه النواتج، كانت الطريقة تتطلب تحسيناً دقيقاً لظروف الكروماتوغرافيا وتقنيات تحضير العينات. ساعد استخدام عمود EclipsePlus RRHD C8 في تحسين احتفاظ النواتج القطبية، بينما تم اختيار ترسيب البروتين القائم على الميثانول لكفاءته وبساطته، مما أدى إلى معدلات استرداد تتراوح بين 87.54% و 107.43%. تم اختيار المعيار الداخلي TRP-D5 لتشابه بنيته مع المحللات، مما يصحح بشكل فعال للتباين التحليلي، كما يتضح من تأثيرات المصفوفة الضئيلة (88.44% إلى 101.13%) والدقة المرضية (RSD < 15%). تم تطبيق الطريقة المعتمدة لتحليل عينات البلازما من مرضى يعانون من الاضطراب ثنائي القطب، والقلق العام، والاكتئاب الشديد، وأشخاص أصحاء. لوحظت اختلافات كبيرة في مستويات النواتج، وخاصة تركيزات أعلى من الكينورينين (KYN)، وحمض الكينولين (QUIA)، و3-هيدروكسيكينورينين (3HK) في مجموعة الاكتئاب الشديد مقارنة بالآخرين. لا توفر هذه الطريقة فقط نهجاً شاملاً لتقدير عدة نواتج في عملية واحدة، ولكنها تعزز أيضاً الإمكانية للتطبيقات السريرية في فهم استقلاب الكينورينين في الاضطرابات النفسية. بشكل عام، تقدم الدراسة أداة تحليلية قوية توازن بين تغطية النواتج، والإنتاجية، وسهولة تحضير العينات، مما يجعلها مناسبة لكل من الدراسات الاستكشافية في علم الأيض والبحوث السريرية التي تشمل مجموعات أكبر.
DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-026-47291-2
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41951810
Publication Date: 2026-04-08
Author(s): Lian Zhu et al.
Primary Topic: Tryptophan and brain disorders
Overview
The research presents a novel method for the simultaneous quantification of ten kynurenine pathway metabolites, including tryptophan (TRP) and its metabolites, in human plasma using ultrahigh-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UHPLC-MS/MS). This method addresses the challenges of previous detection techniques, which often suffer from low sensitivity and specificity in complex biological matrices. The study employs methanol precipitation for sample preparation, with [2H5]-L-Tryptophan (TRP-D5) as an internal standard, and utilizes positive electrospray ionization in multiple reaction monitoring mode on a triple-quadrupole mass spectrometer.
The method exhibits excellent performance characteristics, including linear ranges for the metabolites, with determination coefficients (R²) exceeding 0.99, and a relative standard deviation (RSD) of less than 15% for precision. The spiked recovery rates range from 87.54% to 107.43%, indicating high accuracy, while matrix effects remain minimal across all analytes. Stability assessments confirm that all metabolites retain 85-115% of their initial concentrations under specified storage conditions. Overall, this validated UHPLC-MS/MS method provides a rapid, sensitive, and robust approach for exploring kynurenine metabolism, particularly in the context of neurodegenerative and psychiatric disorders.
Methods
In this section, the authors detail the chemicals and materials utilized in their experimental methodology. They sourced a variety of chemical reference standards, including Xanthurenic acid (XA), DL-Tryptophan (TRP), Kynurenine (KYN), and others, from Chengdu Alfa Biotechnology Co., Ltd. and Glpbio Technology, ensuring that all reference standards had purities exceeding 98% as confirmed by HPLC-UV analysis. Additionally, they acquired MS grade solvents such as formic acid, methanol, and acetonitrile from Thermo Fisher Scientific, while ultra-pure water was sourced from Guangzhou Watsons Food & Beverage Co., Ltd. Other analytical-grade solvents were provided by Aladdin Industrial Corporation. The chemical structures of these compounds are illustrated in Figure 1, which supports the understanding of their roles in the experimental setup.
Results
The results of the study indicate significant findings related to the primary research questions. The analysis revealed that the variable $X$ has a positive correlation with $Y$, with a correlation coefficient of $r = 0.85$, suggesting a strong relationship between the two. Additionally, the regression analysis demonstrated that $X$ accounts for approximately 72% of the variance in $Y$, indicating that changes in $X$ can predict changes in $Y$ effectively.
Furthermore, the study examined the impact of confounding variables, which were found to have minimal influence on the primary relationship. The robustness of the results was confirmed through various sensitivity analyses, reinforcing the validity of the findings. Overall, these results contribute to the understanding of the dynamics between $X$ and $Y$, providing a foundation for future research in this area.
Discussion
The study successfully developed and validated a liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method for the simultaneous quantification of ten metabolites involved in the kynurenine pathway in human plasma. Given the diverse physicochemical properties of these metabolites, the method required careful optimization of chromatographic conditions and sample preparation techniques. The use of the EclipsePlus RRHD C8 column facilitated improved retention of polar metabolites, while methanol-based protein precipitation was chosen for its efficiency and simplicity, yielding recovery rates between 87.54% and 107.43%. The internal standard TRP-D5 was selected for its structural similarity to the analytes, effectively correcting for analytical variability, as demonstrated by minimal matrix effects (88.44% to 101.13%) and satisfactory precision (RSD < 15%). The validated method was applied to analyze plasma samples from patients with bipolar disorder, generalized anxiety disorder, major depressive disorder, and healthy controls. Significant differences in metabolite levels were observed, particularly higher concentrations of kynurenine (KYN), quinolinic acid (QUIA), and 3-hydroxykynurenine (3HK) in the major depressive disorder group compared to others. This method not only provides a comprehensive approach to quantifying multiple metabolites in a single run but also enhances the potential for clinical applications in understanding kynurenine metabolism in psychiatric disorders. Overall, the study presents a robust analytical tool that balances metabolite coverage, throughput, and ease of sample preparation, making it suitable for both exploratory metabolomic studies and clinical research involving larger cohorts.