DOI: https://doi.org/10.1038/s41477-025-01989-9
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40263581
تاريخ النشر: 2025-04-22
المؤلف: Trevor Weiss وآخرون
الموضوع الرئيسي: كريسبر والهندسة الوراثية
نظرة عامة
تناقش هذه الفقرة التقدم في تحرير الجينوم داخل علم الأحياء النباتية، مع تسليط الضوء على التحديات المرتبطة بتوصيل أنظمة التحرير إلى النباتات. غالبًا ما تكون الطرق التقليدية، مثل زراعة الأنسجة والتحويل، بطيئة وتعتمد على النمط الجيني، مما يتطلب إجراءات معقدة لتحقيق تعديلات خالية من الجينات المنقولة. يقترح المؤلفون حلاً مبتكرًا من خلال هندسة فيروس رattle التبغ (TRV) لتوصيل إنزيم TnpB الموجه بواسطة RNA ISYmu1 مع RNA الدليل الخاص به. تتيح هذه الطريقة تحريرًا فعالًا في خطوة واحدة لنبات *Arabidopsis thaliana*، مع وراثة التعديلات الجينية في الأجيال اللاحقة.
تؤكد الأبحاث على إمكانية استخدام الفيروسات النباتية كنظم توصيل لمكونات تحرير الجينوم، مما يمكن أن يعزز بشكل كبير كفاءة التكنولوجيا الحيوية النباتية والبحث الأساسي. من خلال التغلب على قيود طرق التوصيل التقليدية، لا تعمل هذه الطريقة على تبسيط عملية التحرير فحسب، بل تقلل أيضًا من خطر التغيرات الجينية غير المقصودة. تشير النتائج إلى أن استخدام الناقلات الفيروسية يمكن أن يحدث ثورة في طريقة إجراء تحرير الجينوم في النباتات، مما يسهل تطوير أنماط مصممة بشكل عقلاني ويعزز مجال علم الوراثة النباتية.
طرق
في هذه الدراسة، تم إعداد بذور نوع كولومبيا من *Arabidopsis* (Col-0) لعزل البروتوبلاست عن طريق تهيئتها في محلول أجاروز 0.1% عند 4 °م لمدة ثلاثة أيام. بعد التهيئة، تم زراعة البذور في أقراص Jiffy ونمت تحت ظروف ضوء محكومة (دورة ضوء/ظلام لمدة 12 ساعة) عند 20 °م لمدة 3-4 أسابيع. تم إنتاج نباتات معدلة وراثيًا باستخدام نوع Col-0، مع الحصول على النمط الجيني ku70 من مختبر فنغ زانغ. تم هندسة النمط الجيني rdr6 عبر CRISPR-Cas9، مما أدى إلى حذف بطول 616 قاعدة. تم إجراء تحويل الغمر الزهري باستخدام سلالة أجروبكتيريوم Agl0، وتم فحص نباتات T1 المعدلة وراثيًا على أطباق MS ½ تحتوي على 40 ميكروغرام/مل من الهايجرومايسين B.
بالنسبة لتجارب الفيض الزراعي، تم زراعة البذور المعقمة على أطباق أجار MS ½، وتم تهيئتها لمدة خمسة أيام، ثم نمت تحت دورة ضوء/ظلام لمدة 16 ساعة عند 23 °م لمدة 8-10 أيام قبل توصيل TRV. خضعت نباتات T1 المعدلة وراثيًا والمختارة وتلك التي تعرضت للفيض الزراعي لعلاج صدمة حرارية معدل، حيث استمرت النباتات غير المعالجة في النمو في الدفيئة، بينما تعرضت النباتات المعالجة للحرارة لدرجة حرارة 37 °م لمدة 8 ساعات يوميًا على مدى خمسة أيام، تلتها فترة تعافي لمدة يومين عند 23 °م. تم الحفاظ على بروتوكول صدمة الحرارة هذا لمدة أسبوعين لتقييم تأثيره على نمو النبات.
مناقشة
في هذه الدراسة، تم بناء بلازميدات متنوعة للاختبارات البكتيرية والتجارب النباتية، باستخدام استراتيجية استنساخ من خطوتين. تضمنت الخطوة الأولى تخليق تسلسلات ترميز البروتين وRNA ω المقابلة لها ككتل جينية، والتي تم تجميعها بعد ذلك في ناقلات التعبير النباتية باستخدام NEBuilder HiFi DNA Assembly. تضمنت الخطوة الثانية تخليق تسلسلات RNA الدليل وإدماجها في الناقلات من خلال تجميع بوابة الذهب. تم تأكيد التجميع الناجح للبلازميدات من خلال التسلسل، وتم استخدام هذه البلازميدات بعد ذلك في اختبارات التداخل البكتيري وحقن البروتوبلاست.
أظهر اختبار التداخل البكتيري فعالية بلازميد TnpB-ωRNA في استهداف تسلسلات PAM المحددة، مع وحدات تشكيل المستعمرات (c.f.u.s) التي تم تطبيعها لتقييم تأثير ظروف PAM التقليدية مقابل غير التقليدية. تم تحسين بروتوكولات عزل البروتوبلاست والحقن للنباتات *Arabidopsis*، تلتها توصيل TRV للشتلات لتقييم كفاءة تحرير الجينات. تم فحص نسل النباتات المصابة بـ TRV بحثًا عن التعديلات باستخدام التسلسل من الجيل التالي، مع تحليل دقيق للتأثيرات غير المستهدفة والتحقق من التعبير الجيني من خلال RT-PCR. بشكل عام، توفر المنهجيات المستخدمة في هذا البحث إطارًا قويًا لتحرير الجينات في النباتات، مما يبرز الإمكانية للتعديلات الجينية الدقيقة.
DOI: https://doi.org/10.1038/s41477-025-01989-9
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40263581
Publication Date: 2025-04-22
Author(s): Trevor Weiss et al.
Primary Topic: CRISPR and Genetic Engineering
Overview
The section discusses the advancements in genome editing within plant biology, highlighting the challenges associated with delivering editing systems to plants. Traditional methods, such as tissue culture and transformation, are often slow and genotype-specific, necessitating complex procedures to achieve transgene-free modifications. The authors propose an innovative solution by engineering the tobacco rattle virus (TRV) to deliver the compact RNA-guided TnpB enzyme ISYmu1 along with its guide RNA. This method enables efficient, single-step editing of *Arabidopsis thaliana*, with the genetic modifications being inherited in subsequent generations.
The research underscores the potential of using plant viruses as delivery systems for genome editing reagents, which could significantly enhance the efficiency of plant biotechnology and fundamental research. By overcoming the limitations of conventional delivery methods, this approach not only streamlines the editing process but also minimizes the risk of unintended genomic alterations. The findings suggest that utilizing viral vectors could revolutionize the way genome editing is performed in plants, facilitating the development of rationally designed phenotypes and advancing the field of plant genetics.
Methods
In this study, Arabidopsis Columbia ecotype (Col-0) seeds were prepared for protoplast isolation by stratifying them in a 0.1% agarose solution at 4 °C for three days. Following stratification, the seeds were planted in Jiffy pucks and grown under controlled light conditions (12-h light/dark cycle) at 20 °C for 3-4 weeks. Transgenic plants were generated using the Col-0 ecotype, with the ku70 genotype sourced from the Feng Zhang lab. The rdr6 genotype was engineered via CRISPR-Cas9, resulting in a 616-bp deletion. Floral dip transformation was conducted using the Agl0 Agrobacterium strain, and transgenic T1 plants were screened on ½ MS plates containing 40 µg/ml hygromycin B.
For agroflood experiments, sterilized seeds were sown on ½ MS agar plates, stratified for five days, and subsequently grown under a 16-h light/dark cycle at 23 °C for 8-10 days before TRV delivery. Selected transgenic T1 plants and those subjected to agroflood underwent a modified heat-shock treatment, where non-treated plants continued growth in the greenhouse, while heat-shocked plants were exposed to 37 °C for 8 hours daily over five days, followed by a two-day recovery period at 23 °C. This heat-shock protocol was maintained for two weeks to assess the impact on plant development.
Discussion
In this study, various plasmids were constructed for bacterial assays and plant experiments, utilizing a two-step cloning strategy. The first step involved synthesizing protein-coding sequences and their corresponding ωRNAs as geneblocks, which were then assembled into plant expression vectors using NEBuilder HiFi DNA Assembly. The second step involved synthesizing guide RNA sequences and incorporating them into the vectors through golden-gate assembly. The successful assembly of plasmids was confirmed by sequencing, and these plasmids were subsequently used in bacterial interference assays and protoplast transfections.
The bacterial interference assay demonstrated the effectiveness of the TnpB-ωRNA plasmid in targeting specific PAM sequences, with colony-forming units (c.f.u.s) normalized to assess the impact of canonical versus non-canonical PAM conditions. Protoplast isolation and transfection protocols were optimized for Arabidopsis, followed by TRV delivery to seedlings to evaluate gene editing efficiency. The progeny of TRV-infected plants were screened for edits using next-generation sequencing, with careful analysis of off-target effects and validation of gene expression through RT-PCR. Overall, the methodologies employed in this research provide a robust framework for gene editing in plants, highlighting the potential for precise genetic modifications.