DOI: https://doi.org/10.1186/s12967-025-06283-y
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40188077
تاريخ النشر: 2025-04-05
المؤلف: Mengke Zhao وآخرون
الموضوع الرئيسي: الحويصلات خارج الخلوية في الأمراض
نظرة عامة
تبحث هذه الدراسة في التأثيرات الوقائية للإكسوزومات المشتقة من خلايا الجذع العصبي البشري (hNSC-Exos) على تلف الخلايا العصبية الناتج عن السكتة الدماغية الإقفارية (IS) والإجهاد التأكسدي (OS). يتم تسليط الضوء على الميتوكوندريا كأهداف حاسمة في التخفيف من إصابة الخلايا العصبية خلال IS، ويتم اقتراح hNSC-Exos كنهج علاجي واعد. باستخدام نموذج جرذان لانسداد الشريان الدماغي الأوسط (MCAO) وخلايا HT22 المستحثة بالإجهاد التأكسدي، قام الباحثون بإعطاء hNSC-Exos عبر الحقن الستيريوتاكسي وتقييم تأثيراتها من خلال الدراسات النسيجية والتقييمات السلوكية. في المختبر، تم تقييم التأثيرات الوقائية من خلال تقنيات متنوعة، بما في ذلك صبغ المناعة الفلورية وتسلسل RNA لاستكشاف تحفيز الميتوفاجي.
تشير النتائج إلى أن hNSC-Exos قللت بشكل كبير من تلف أنسجة الدماغ وموت الخلايا المبرمج في جرذان MCAO، بينما عززت تكوين الأعصاب ومرونة الأعصاب. كما وجدت الدراسة أن hNSC-Exos تعدل مسار الميتوفاجي PINK1/Parkin، مما يعزز إصلاح الخلايا العصبية ويخفف من الضرر الناتج عن OS. كعلاج خالٍ من الخلايا، تقدم hNSC-Exos مزايا على العلاجات التقليدية لخلايا الجذع، مثل تقليل المناعية والسرطانية. ومع ذلك، تعترف الدراسة بالقيود المتعلقة بطبيعتها قبل السريرية ونتائجها قصيرة المدى، مما يشير إلى أن الأبحاث المستقبلية يجب أن تركز على التوصيف الجزيئي لـ hNSC-Exos، وتحسين توصيلها، والتحقق من فعاليتها وسلامتها على المدى الطويل في البيئات السريرية لـ IS وغيرها من الاضطرابات العصبية المرتبطة بخلل الميتوكوندريا.
مقدمة
تسلط مقدمة ورقة البحث الضوء على الدور الحاسم للميتوكوندريا في استقلاب الطاقة وتأثيرها السلبي خلال السكتة الدماغية الإقفارية (IS) بسبب نقص الجلوكوز والأكسجين. يؤدي هذا التأثير السلبي إلى تقليل كفاءة نقل الإلكترونات، وزيادة تسرب الإلكترونات، وتوليد أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS)، التي تحفز الإجهاد التأكسدي (OS) وتسبب تلف الميتوكوندريا. إن استعادة الأكسجين خلال مرحلة إصابة نقص التروية/إعادة التروية الدماغية (CIRI) تزيد من إنتاج ROS وتؤدي إلى خلل الميتوكوندريا، مما يساهم في تسلسل الأمراض الناتجة عن IS. تؤكد الورقة على الحاجة إلى استراتيجيات علاجية تستهدف تنظيم الميتوكوندريا وتأثيرات مضادات الأكسدة للتخفيف من الضرر الثانوي الناتج عن OS خلال CIRI.
تمت مناقشة إمكانيات خلايا الجذع، وخاصة خلايا الجذع العصبي البشري (hNSCs) والإكسوزومات المشتقة منها (hNSC-Exos)، كمسار واعد لعلاج الاضطرابات العصبية مثل IS. تُلاحظ hNSC-Exos لقدرتها على توصيل جزيئات حيوية نشطة تعزز الحماية العصبية والإصلاح، مما يعالج خلل الميتوكوندريا الناتج عن OS. تستكشف الورقة أيضًا دور الميتوفاجي في موت الخلايا العصبية وتسلط الضوء على مسار PINK1/Parkin كهدف رئيسي للتدخل العلاجي. يقترح المؤلفون أن hNSC-Exos تعزز وظيفة الميتوكوندريا وتقلل من موت الخلايا العصبية من خلال تعزيز الميتوفاجي، مما يشير إلى إمكانياتها كنهج علاجي جديد للأمراض العصبية المركزية المرتبطة بـ OS، بما في ذلك IS.
الطرق
في هذه الدراسة، تم استخدام 30 جرذًا ذكرًا بالغًا صحيًا من نوع Sprague Dawley (SD)، تتراوح أعمارهم بين 8-10 أسابيع ووزنهم بين 250-280 جرامًا، كمواضيع تجريبية. تم الحصول على الجرذان من مركز تجارب الحيوانات في جامعة داليان الطبية وتم السماح لهم بفترة تأقلم مع بيئة المختبر. التزمت التجارب بالمعايير الأخلاقية المعتمدة من قبل لجنة الأخلاقيات في مركز تجارب الحيوانات، وفقًا لدليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية (رقم أخلاقي AEE23127، 28 فبراير 2023).
تمت تربية الجرذان في بيئة خاضعة للرقابة مع ظروف محددة: رطوبة نسبية 50%، ودرجة حرارة 22 ± 2 °م، ودورة ضوء/ظلام لمدة 12 ساعة، مع وصول غير محدود إلى طعام الجرذان العادي والماء. تم استبعاد أي جرذان توفيت مبكرًا من الدراسة لضمان سلامة جمع البيانات السلوكية والنسيجية. في نهاية فترة المراقبة، تم إعدام الجرذان بطريقة إنسانية باستخدام ثاني أكسيد الكربون، وفقًا للإرشادات المؤسسية، وتوافق تقرير الدراسة مع إرشادات ARRIVE للتجارب الحية.
النتائج
في هذه الدراسة، تم عزل الإكسوزومات المشتقة من خلايا الجذع العصبي البشري (hNSC-Exos) بنجاح من سوائل الثقافة لخلايا الجذع العصبي البشري (hNSCs) المشتقة من أنسجة الدماغ الأمامية الجنينية. تم زراعة hNSCs في نظام زراعة لاصق مغطى بماتريجيل، حيث أظهرت شكلًا مميزًا يشبه المغزل أو الشكل المضلع. تم تأكيد نمط الخلايا العصبية من خلال صبغ المناعة الفلورية لـ Nestin وSOX2. تم تحقيق عزل hNSC-Exos باستخدام الطرد المركزي التفاضلي، وشمل توصيفها التحليل الغربي (WB)، وتحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA)، والمجهر الإلكتروني الناقل (TEM).
أكد تحليل WB وجود علامات سطحية للإكسوزومات CD9 وCD63 وCD81 وTSG101، بينما أكد غياب العلامة السلبية Calnexin نقاء تحضير الإكسوزوم. كشفت صور TEM عن الهيكل النموذجي لغشاء الدهون ثنائي الطبقة لـ hNSC-Exos، والذي يتميز بشكل “فم الكوب”. أشارت قياسات NTA إلى أن الإكسوزومات تتراوح من 20 إلى 150 نانومتر في القطر، مع إمكانيات زتا تتراوح بين -25 و-60 مللي فولت، مما يشير إلى استقرار عالٍ وتوزيع متجانس. مع الالتزام بإرشادات MISEV2018 لتوصيف الحويصلات خارج الخلوية، تؤكد هذه النتائج العزل الناجح والتوصيف الوظيفي لـ hNSC-Exos لتطبيقات البحث المستقبلية.
المناقشة
في هذه الدراسة، تم استخدام خلايا الحصيني العصبية (HT22) وخلايا الجذع العصبي البشري (hNSCs) للتحقيق في الإجهاد التأكسدي (OS) ومسارات الميتوفاجي. تم زراعة خلايا HT22 تحت ظروف خاضعة للرقابة وتعرضت لـ OS من خلال العلاج فوق أكسيد الهيدروجين (H₂O₂) لإنشاء نموذج إصابة الخلايا. تم أيضًا تقييم تأثير مثبط الميتوفاجي Mdivi-1 في هذا السياق. تم عزل hNSCs من أنسجة الدماغ الجنينية وزراعتها وفقًا لإرشادات أخلاقية صارمة، مما يضمن بقاء عالي وجودة التحكم طوال التجارب. تم عزل الإكسوزومات المشتقة من hNSCs (hNSC-Exos) باستخدام الطرد المركزي الفائق، وتم توصيفها من حيث الحجم ومحتوى البروتين، واستخدمت لاحقًا في تجارب الزراعة المشتركة مع خلايا HT22 لتقييم تأثيراتها الوقائية ضد موت الخلايا الناتج عن OS.
شملت المنهجية مجموعة متنوعة من الاختبارات لتقييم بقاء الخلايا، وموت الخلايا، ووظيفة الميتوكوندريا، مثل صبغ TUNEL، وتدفق السيتومتر، واكتشاف جهد الغشاء الميتوكوندري. بالإضافة إلى ذلك، تم استخدام PCR الكمي في الوقت الحقيقي (qRT-PCR) والتحليل الغربي لتحليل التعبير الجيني والبروتيني المتعلق بموت الخلايا والالتهام الذاتي. تضمنت الدراسة أيضًا استخدام نماذج حيوانية لتقييم التأثيرات في الجسم الحي لـ hNSC-Exos بعد إصابة نقص التروية/إعادة التروية. بشكل عام، تشير النتائج إلى أن hNSC-Exos قد تلعب دورًا كبيرًا في التخفيف من تلف الخلايا العصبية الناجم عن الإجهاد التأكسدي، ربما من خلال تعديل موت الخلايا وتعزيز وظيفة الميتوكوندريا.
DOI: https://doi.org/10.1186/s12967-025-06283-y
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40188077
Publication Date: 2025-04-05
Author(s): Mengke Zhao et al.
Primary Topic: Extracellular vesicles in disease
Overview
This study investigates the protective effects of exosomes derived from human neural stem cells (hNSC-Exos) on neuronal damage induced by ischemic stroke (IS) and oxidative stress (OS). Mitochondria are highlighted as critical targets in mitigating neuronal injury during IS, and hNSC-Exos are proposed as a promising therapeutic approach. Using a rat model of middle cerebral artery occlusion (MCAO) and OS-induced HT22 cells, the researchers administered hNSC-Exos via stereotaxic injection and evaluated their effects through histological studies and behavioral assessments. In vitro, the protective effects were assessed through various techniques, including immunofluorescence staining and RNA sequencing to explore the induction of mitophagy.
The results indicate that hNSC-Exos significantly reduced brain tissue damage and apoptosis in MCAO rats, while enhancing neurogenesis and neuroplasticity. The study also found that hNSC-Exos modulate the PINK1/Parkin mitophagy pathway, thereby promoting neuronal repair and alleviating OS-induced damage. As a cell-free therapy, hNSC-Exos present advantages over traditional stem cell therapies, such as reduced immunogenicity and tumorigenicity. However, the study acknowledges limitations related to its preclinical nature and short-term outcomes, suggesting that future research should focus on the molecular characterization of hNSC-Exos, optimizing their delivery, and validating their long-term efficacy and safety in clinical settings for IS and other neurological disorders associated with mitochondrial dysfunction.
Introduction
The introduction of the research paper highlights the critical role of mitochondria in energy metabolism and their impairment during ischemic stroke (IS) due to a lack of glucose and oxygen. This impairment leads to reduced electron transport efficiency, increased electron leakage, and the generation of reactive oxygen species (ROS), which trigger oxidative stress (OS) and subsequent mitochondrial damage. The restoration of oxygen during the cerebral ischemia/reperfusion injury (CIRI) phase exacerbates ROS production and mitochondrial dysfunction, contributing to the pathogenic cascade of IS. The paper emphasizes the need for therapeutic strategies targeting mitochondrial regulation and antioxidant effects to mitigate secondary damage from OS during CIRI.
The potential of stem cells, particularly human neural stem cells (hNSCs) and their derived exosomes (hNSC-Exos), is discussed as a promising avenue for treating neurological disorders like IS. hNSC-Exos are noted for their ability to deliver bioactive molecules that promote neuroprotection and repair, addressing OS-mediated mitochondrial dysfunction. The paper also explores the role of mitophagy in neuronal apoptosis and highlights the PINK1/Parkin pathway as a key target for therapeutic intervention. The authors propose that hNSC-Exos enhance mitochondrial function and reduce neuronal apoptosis by promoting mitophagy, suggesting their potential as a novel therapeutic approach for OS-related central nervous system diseases, including IS.
Methods
In this study, 30 healthy adult male Sprague Dawley (SD) rats, aged 8-10 weeks and weighing between 250-280 g, were utilized as experimental subjects. The rats were sourced from the Animal Experiment Center of Dalian Medical University and were allowed a period of acclimatization to the laboratory environment. The experiments adhered to ethical standards approved by the Ethics Committee of the Animal Experiment Center, following the National Institutes of Health’s Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (Ethical No. AEE23127, Feb. 28th, 2023).
The rats were housed in a controlled environment with specific conditions: 50% relative humidity, a temperature of 22 ± 2 °C, and a 12-hour light/dark cycle, with unrestricted access to standard rat food and water. Any rats that died prematurely were excluded from the study to ensure the integrity of behavioral and histological data collection. At the conclusion of the observation period, the rats were humanely euthanized using carbon dioxide, in compliance with institutional guidelines, and the study’s reporting conformed to the ARRIVE guidelines for in vivo experiments.
Results
In this study, human neural stem cell-derived exosomes (hNSC-Exos) were successfully isolated from the culture supernatants of human neural stem cells (hNSCs) derived from fetal forebrain tissues. The hNSCs were cultivated in a matrigel-coated adherent culture system, exhibiting characteristic fusiform or polygonal morphology. The neural stem phenotype was confirmed through immunofluorescence staining for Nestin and SOX2. The isolation of hNSC-Exos was achieved using differential gradient centrifugation, and their characterization involved Western blotting (WB), nanoparticle tracking analysis (NTA), and transmission electron microscopy (TEM).
The WB analysis confirmed the presence of exosomal surface markers CD9, CD63, CD81, and TSG101, while the absence of the negative marker Calnexin validated the purity of the exosome preparation. TEM imaging revealed the typical bilayer lipid membrane structure of hNSC-Exos, characterized by a “cup-mouth” morphology. NTA measurements indicated that the exosomes ranged from 20 to 150 nm in diameter, with zeta potentials between -25 and -60 mV, suggesting high stability and uniform dispersion. Adhering to the MISEV2018 guidelines for extracellular vesicle characterization, these results affirm the successful isolation and characterization of functional hNSC-Exos for further research applications.
Discussion
In this study, mouse hippocampal neurons (HT22) and human neural stem cells (hNSCs) were utilized to investigate oxidative stress (OS) and mitophagy pathways. HT22 cells were cultured under controlled conditions and subjected to OS by treatment with hydrogen peroxide (H₂O₂) to establish a cell injury model. The effects of the mitophagy inhibitor Mdivi-1 were also assessed in this context. hNSCs were isolated from fetal brain tissue and cultured under strict ethical guidelines, ensuring high viability and quality control throughout the experiments. Exosomes derived from hNSCs (hNSC-Exos) were isolated using ultracentrifugation, characterized for size and protein content, and subsequently used in co-culture experiments with HT22 cells to evaluate their protective effects against OS-induced apoptosis.
The methodology included various assays to assess cell viability, apoptosis, and mitochondrial function, such as TUNEL staining, flow cytometry, and mitochondrial membrane potential detection. Additionally, quantitative real-time PCR (qRT-PCR) and Western blotting were employed to analyze gene and protein expression related to apoptosis and autophagy. The study also involved the use of animal models to evaluate the in vivo effects of hNSC-Exos following ischemia-reperfusion injury. Overall, the findings suggest that hNSC-Exos may play a significant role in mitigating neuronal damage caused by oxidative stress, potentially through modulation of apoptosis and enhancement of mitochondrial function.