DOI: https://doi.org/10.1038/s41420-024-02169-y
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39256347
تاريخ النشر: 2024-09-10
المؤلف: Longyu Miao وآخرون
الموضوع الرئيسي: البلعمة وتنظيم المناعة
نظرة عامة
تسبب إصابة نقص التروية وإعادة التروية الكبدية (HIRI) مخاطر كبيرة أثناء زراعة الكبد والجراحة، مما يؤدي غالبًا إلى فشل الكبد أو الوفاة. تبحث هذه الدراسة في الإمكانات العلاجية للجسيمات خارج الخلوية المستمدة من خلايا جذعية ميزانشيمية (MSC-EVs) في التخفيف من HIRI. تشير النتائج إلى أن MSC-EVs يتم امتصاصها بشكل أساسي بواسطة البلعميات، مما يؤدي إلى تقليل ملحوظ في إصابة الكبد والاستجابات الالتهابية في نموذج الفأر لـ HIRI. ومن الجدير بالذكر أن MSC-EVs تعزز استقطاب البلعميات نحو نمط ظاهري مضاد للالتهابات.
من الناحية الآلية، يكشف التحليل البروتيني أن MSC-EVs غنية بـ GAS6، الذي ينشط مسار الإشارة MerTK/ERK/COX2 في البلعميات، مما يعزز كفاءتها في البلعمة. تتضاءل التأثيرات الوقائية لـ MSC-EVs على وظيفة البلعميات وإصابة الكبد عندما يتم تقليل GAS6 أو عندما يتم تثبيط MerTK باستخدام UNC2025، وهو مثبط جزيئي صغير. تؤكد هذه النتائج على دور MSC-EVs الغنية بـ GAS6 في تعديل نشاط البلعميات، مما يشير إلى أن هذه الطريقة قد تكون استراتيجية واعدة لمعالجة إصابات نقص التروية وإعادة التروية.
مقدمة
تتناول مقدمة ورقة البحث القضية الحرجة لإصابة نقص التروية/إعادة التروية الكبدية (HIRI)، وهي تحدٍ كبير في زراعة الكبد والعمليات الجراحية. تتكون HIRI من مرحلتين: الهجوم الإقفاري الأولي الذي يؤدي إلى موت الخلايا الكبدية بسبب استنفاد الجليكوجين ونقص الأكسجين، تليه مرحلة إعادة التروية التي تتميز باستجابة التهابية تتوسطها بشكل أساسي البلعميات والعدلات. تؤكد الورقة على أهمية إيجاد استراتيجيات فعالة للتخفيف من HIRI، لا سيما من خلال عملية البلعمة، حيث تقوم البلعميات بإزالة الخلايا الميتة، مما يعزز حل الالتهاب وإصلاح الأنسجة. تسهل هذه العملية من خلال التعرف على إشارات الخلايا الميتة بواسطة مستقبلات البلعميات، ولا سيما كيناز التيروزين المايلويدي-الظهاري-التناسلي (MerTK)، والجزيئات الوسيطة مثل GAS6.
علاوة على ذلك، تسلط المقدمة الضوء على إمكانات خلايا الجذعية الميزانشيمية (MSCs) وجسيماتها خارج الخلوية (EVs) في إصلاح الأنسجة وتعديل المناعة. لقد أظهرت MSC-EVs، التي تحتوي على مجموعة متنوعة من الجزيئات النشطة حيويًا، تأثيرات وقائية ضد HIRI، على الرغم من أن الآليات الأساسية لا تزال غير واضحة. تهدف الدراسة الحالية إلى توضيح هذه الآليات، موضحة أن MSC-EVs غنية بـ GAS6 وتعزز استقطاب البلعميات من النوع M2، مما يعزز البلعمة وييسر الإزالة السريعة للخلايا الميتة. هذه العملية حاسمة لاستعادة توازن الكبد بعد HIRI، مما يبرز الإمكانات العلاجية لاستهداف إشارات البلعمة في إدارة إصابات الكبد.
الطرق
في هذه الدراسة، تم استخدام نموذج فأر لإصابة نقص التروية وإعادة التروية الكبدية (HIRI) باستخدام ذكور الفئران C57BL/6 الذين تتراوح أعمارهم بين 8-10 أسابيع، تم الحصول عليهم من شركة بكين هوا فوكينغ للتكنولوجيا الحيوية المحدودة. تم الالتزام بجميع الإجراءات بالإرشادات الأخلاقية التي وضعتها لجنة أخلاقيات الحيوانات التجريبية بجامعة تشينغداو (QDU-AEC-2023360). خضعت الفئران لفترة صيام لمدة 12 ساعة قبل الجراحة، تلتها تخدير باستخدام 2% إيزوفلوران. تم إجراء شق بطني في منتصف البطن، وتم تقليل تدفق الدم الكبدي بنسبة تقارب 70% من خلال تطبيق مشبك وعائي غير جراحي على الوريد البابي والشريان الكبدي.
بعد نقص التروية، تم تخصيص الفئران (n = 5 لكل مجموعة) عشوائيًا إلى واحدة من خمس مجموعات علاجية: مجموعة الشام، نقص التروية/إعادة التروية (I/R) + المركب (PBS، 200 ميكرولتر)، I/R + جسيمات خارج الخلوية المستمدة من MSC (MSCs-EVs، $2 \times 10^{10}$ جزيء/جسم)، I/R + UNC2025 (50 ملغ/كغ) + MSCs-EVs ($2 \times 10^{10}$ جزيء/جسم)، و sh-NC-MSCs-EVs أو sh-GAS6-MSCs-EVs ($2 \times 10^{10}$ جزيء/جسم). تمت إزالة المشبك الوعائي بعد حوالي 60 دقيقة، تلتها فترة إعادة التروية لمدة 6 أو 24 ساعة، حيث تم جمع عينات من أنسجة الكبد والدم لمزيد من التحليل.
النتائج
في هذه الدراسة، تم عزل وتوصيف الجسيمات خارج الخلوية المستمدة من خلايا الجذعية الميزانشيمية المشتقة من نخاع العظام للفئران (mBM-MSC-EVs) لتقييم خصائصها وتوزيعها داخل الجسم بعد إصابة نقص التروية وإعادة التروية الكبدية (HIRI). أظهرت mBM-MSCs علامات سطحية نموذجية وإمكانات تمايز متعددة الخطوط، مما يؤكد هويتها. كشفت تحليل تتبع الجسيمات النانوية أن MSC-EVs المعزولة تتراوح بشكل أساسي من 100-200 نانومتر في الحجم، وأكدت المجهر الإلكتروني الناقل شكلها المميز على شكل كوب. حدد تحليل المناعية وجود Alix وTSG101 وCD9، بما يتماشى مع المعايير المعتمدة للجسيمات خارج الخلوية.
لتقييم توزيع MSC-EVs في نموذج فأر HIRI، تم إعطاء MSC-EVs الملونة بـ Cy5.5 عن طريق حقنها في الوريد الذيل بعد الجراحة. أظهرت التصوير داخل الجسم تراكمًا كبيرًا لفلوريسcence Cy5.5 في أنسجة الكبد المصابة بعد 6 ساعات من الجراحة. كشفت التحليلات اللاحقة أن امتصاص MSC-EVs كان بشكل تفضيلي بواسطة البلعميات الكبدية، كما يتضح من التوضع المشترك مع علامة F4/80، حيث تم قياس تدفق الخلايا أن 22.7 ± 1.4% من البلعميات الإيجابية لـ F4/80 قد استوعبت الجسيمات، مقارنةً بـ 0.44 ± 0.05% فقط في الخلايا السلبية لـ F4/80. تشير هذه النتائج إلى آلية توصيل مستهدفة لـ MSC-EVs إلى البلعميات في سياق إصابة الكبد.
المناقشة
في هذه الدراسة، تم التحقيق في الإمكانات العلاجية للجسيمات خارج الخلوية المستمدة من خلايا الجذعية الميزانشيمية (MSC-EVs) في التخفيف من إصابة نقص التروية وإعادة التروية الكبدية (HIRI). تشير النتائج إلى أنه بينما لم تغير MSC-EVs بشكل كبير تليف الكبد على المدى الطويل، إلا أنها قللت بشكل فعال من إصابة الكبد والاستجابات الالتهابية بعد HIRI. كشفت التحليلات النسيجية أن علاج MSC-EV حافظ على سلامة الخلايا الكبدية وقلل من علامات تلف الكبد، مثل مستويات الألانين أمينوترانسفيراز (ALT) والأسبارتات أمينوترانسفيراز (AST). بالإضافة إلى ذلك، عززت MSC-EVs تحول استقطاب البلعميات نحو نمط M2، مما زاد من نشاط البلعمة لديها وقلل من تعبير السيتوكينات المؤيدة للالتهابات.
من الناحية الآلية، حددت ملفات التعريف البروتينية غنى GAS6 في MSC-EVs، والذي أظهر أنه ينشط مسار الإشارة MerTK/ERK/COX2 في البلعميات المستمدة من نخاع العظام (BMDMs). سهل هذا التنشيط البلعمة لدى البلعميات وساهم في التأثيرات الوقائية الملحوظة ضد إصابة الكبد. من المهم أن يؤدي كتم GAS6 أو تثبيط مسار MerTK إلى تقليل فعالية MSC-EVs، مما يبرز الدور الحاسم لـ GAS6 في الوساطة لهذه التأثيرات. بشكل عام، تسلط الدراسة الضوء على إمكانات MSC-EVs كاستراتيجية علاجية مستهدفة لـ HIRI، مع التأكيد على قدرتها على تعديل سلوك البلعميات وتعزيز إصلاح الأنسجة دون تفاقم التليف.
DOI: https://doi.org/10.1038/s41420-024-02169-y
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39256347
Publication Date: 2024-09-10
Author(s): Longyu Miao et al.
Primary Topic: Phagocytosis and Immune Regulation
Overview
Hepatic ischemia-reperfusion injury (HIRI) poses significant risks during liver transplantation and surgery, often leading to liver failure or mortality. This study investigates the therapeutic potential of extracellular vesicles derived from mesenchymal stem cells (MSC-EVs) in mitigating HIRI. The findings indicate that MSC-EVs are primarily taken up by macrophages, resulting in a marked reduction of liver injury and inflammatory responses in a mouse model of HIRI. Notably, MSC-EVs promote the polarization of macrophages towards an anti-inflammatory phenotype.
Mechanistically, proteomic analysis reveals that MSC-EVs are enriched with growth arrest-specific 6 (GAS6), which activates the MerTK/ERK/COX2 signaling pathway in macrophages, thereby enhancing their efferocytosis efficiency. The protective effects of MSC-EVs on macrophage function and liver injury are diminished when GAS6 is knocked down or when MerTK is inhibited using UNC2025, a small molecule inhibitor. These results underscore the role of GAS6-enriched MSC-EVs in modulating macrophage activity, suggesting that this approach could be a promising strategy for addressing ischemia-reperfusion injuries.
Introduction
The introduction of the research paper addresses the critical issue of hepatic ischemia/reperfusion injury (HIRI), a significant challenge in liver transplantation and surgeries. HIRI consists of two phases: the initial ischemic insult leading to hepatocyte death due to glycogen depletion and oxygen deprivation, followed by a reperfusion phase marked by an inflammatory response mediated primarily by macrophages and neutrophils. The paper emphasizes the importance of finding effective strategies to mitigate HIRI, particularly through the process of efferocytosis, where macrophages clear dead cells, thus promoting inflammation resolution and tissue repair. This process is facilitated by the recognition of apoptotic cell signals by macrophage receptors, notably myeloid-epithelial-reproductive tyrosine kinase (MerTK), and bridging molecules like growth arrest-specific 6 (GAS6).
Furthermore, the introduction highlights the potential of mesenchymal stem cells (MSCs) and their extracellular vesicles (EVs) in tissue repair and immunomodulation. MSC-EVs, which contain various bioactive molecules, have shown protective effects against HIRI, although the underlying mechanisms remain unclear. The current study aims to elucidate these mechanisms, demonstrating that MSC-EVs are enriched in GAS6 and promote M2 macrophage polarization, thereby enhancing macrophage efferocytosis and facilitating the rapid clearance of apoptotic cells. This process is crucial for restoring liver homeostasis following HIRI, underscoring the therapeutic potential of targeting phagocytic signaling in liver injury management.
Methods
In this study, a mouse model of hepatic ischemia-reperfusion injury (HIRI) was employed using male C57BL/6 mice aged 8-10 weeks, sourced from Beijing Hua Fukang Biotechnology Co., Ltd. All procedures adhered to ethical guidelines set by the Experimental Animal Ethics Committee of Qingdao University (QDU-AEC-2023360). Mice underwent a 12-hour fasting period prior to surgery, followed by anesthesia with 2% isoflurane. A midline laparotomy was performed, and hepatic blood flow was reduced by approximately 70% through the application of a non-invasive vascular clip to the portal vein and hepatic artery.
Post-ischemia, the mice (n = 5 per group) were randomly assigned to one of five treatment groups: sham, ischemia/reperfusion (I/R) + Vehicle (PBS, 200 µL), I/R + MSC-derived extracellular vesicles (MSCs-EVs, $2 \times 10^{10}$ particles/body), I/R + UNC2025 (50 mg/kg) + MSCs-EVs ($2 \times 10^{10}$ particles/body), and sh-NC-MSCs-EVs or sh-GAS6-MSCs-EVs ($2 \times 10^{10}$ particles/body). The vascular clip was removed after approximately 60 minutes, followed by a reperfusion period of 6 or 24 hours, during which liver tissue and blood samples were collected for further analysis.
Results
In this study, mouse bone marrow-derived mesenchymal stem cell extracellular vesicles (mBM-MSC-EVs) were isolated and characterized to assess their properties and in vivo distribution following hepatic ischemia-reperfusion injury (HIRI). The mBM-MSCs exhibited typical surface markers and multilineage differentiation potential, confirming their identity. Nanoparticle tracking analysis revealed that the isolated MSC-EVs predominantly ranged from 100-200 nm in size, and transmission electron microscopy confirmed their characteristic cup-shaped morphology. Immunoblot analysis identified the presence of Alix, TSG101, and CD9, consistent with established criteria for extracellular vesicles.
To evaluate the distribution of MSC-EVs in a HIRI mouse model, Cy5.5-stained MSC-EVs were administered via tail vein injection post-surgery. In vivo imaging indicated significant accumulation of Cy5.5 fluorescence in the injured liver tissue at 6 hours post-surgery. Subsequent analysis revealed that the uptake of MSC-EVs was preferentially by hepatic macrophages, as evidenced by co-localization with the F4/80 marker, with flow cytometry quantifying that 22.7 ± 1.4% of F4/80 positive macrophages internalized the EVs, compared to only 0.44 ± 0.05% in F4/80 negative cells. These findings suggest a targeted delivery mechanism of MSC-EVs to macrophages in the context of liver injury.
Discussion
In this study, the therapeutic potential of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles (MSC-EVs) in mitigating hepatic ischemia-reperfusion injury (HIRI) was investigated. The findings indicate that while MSC-EVs did not significantly alter long-term liver fibrosis, they effectively reduced liver injury and inflammatory responses following HIRI. Histological analyses revealed that MSC-EV treatment preserved hepatocyte integrity and decreased markers of liver damage, such as alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) levels. Additionally, MSC-EVs promoted a shift in macrophage polarization towards an M2 phenotype, enhancing their efferocytosis activity and reducing pro-inflammatory cytokine expression.
Mechanistically, proteomic profiling identified the enrichment of growth arrest-specific 6 (GAS6) in MSC-EVs, which was shown to activate the MerTK/ERK/COX2 signaling pathway in bone marrow-derived macrophages (BMDMs). This activation facilitated macrophage efferocytosis and contributed to the observed protective effects against liver injury. Importantly, silencing GAS6 or inhibiting the MerTK pathway diminished the efficacy of MSC-EVs, underscoring the critical role of GAS6 in mediating these effects. Overall, the study highlights the potential of MSC-EVs as a targeted therapeutic strategy for HIRI, emphasizing their ability to modulate macrophage behavior and promote tissue repair without exacerbating fibrosis.