DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-025-10079-x
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41639443
تاريخ النشر: 2026-02-04
المؤلف: Katarina Pfeifer وآخرون
الموضوع الرئيسي: آليات تفاعل السيكلوبروبان
طرق
في هذا القسم، يوضح المؤلفون المنهجيات المستخدمة في تجاربهم، مع التركيز على عمليات التخليق والتنقية. تم إجراء تخليق البرايمر وتسلسل الحمض النووي بواسطة Genewiz، بينما تم استخدام مجموعة EZNA Plasmid DNA Mini Kit من Omega Bio-Tek لتنقية البلازميد المؤتلف. شملت الدراسة استخدام إنزيمات التقييد من New England Biolabs، حيث تم إجراء الهضم وفقًا للبروتوكولات المعتمدة. بالنسبة للتجميع، تم أيضًا الحصول على خليط جيبسون من New England Biolabs، وتم تنفيذ التجميع المقابل وفقًا لإرشادات الشركة المصنعة.
بالإضافة إلى ذلك، يوضح المؤلفون المواد المستخدمة في تجاربهم، بما في ذلك راتنج حمض النيتريلونيك (Ni-NTA) من Qiagen وThermo Fisher Scientific، بالإضافة إلى مجموعة متنوعة من المواد الكيميائية مثل بنزيليدين هيدرازين وNADPH. تم قياس تركيزات البروتين بواسطة امتصاص الأشعة فوق البنفسجية عند 280 نانومتر باستخدام Thermo Scientific NanoDrop 2000، مع حساب معاملات الانقراض عبر ExPASy ProtParam. تم قياس الكثافات الضوئية لثقافات E. coli عند 600 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي Beckman Coulter DU730 Life Sciences UV/Vis. تم إجراء جميع التجارب في ثلاث نسخ بيولوجية، مع تقديم البيانات كنقاط فردية مع أشرطة خطأ (± 1 انحراف معياري) أو كنتائج تمثيلية.
نقاش
في هذه الدراسة، يقدم المؤلفون سير عمل قائم على التفاعل يهدف إلى اكتشاف المنتجات الطبيعية المحتوية على الدياز، مع معالجة القيود التي تواجه طرق اكتشاف المنتجات الطبيعية التقليدية التي غالبًا ما تتجاهل المركبات غير المستقرة. من خلال استخدام مجموعات الدياز الوظيفية كأدوات تفاعلية للتعديل الكيميائي، تمكن الباحثون من تحديد وتوصيف مستقلبات جديدة من البكتيريا *Nocardia ninae*. شمل سير العمل استخدام حمض الديبنزوسيكلاكتين C-6 (حمض DBCO) لوضع علامة على المستقلبات المحتوية على الدياز، مما يسهل اكتشافها من خلال الكروماتوغرافيا السائلة-مطيافية الكتلة (LC-MS). لم تعزز هذه الطريقة فقط استقرار واكتشاف المستقلبات، بل أدت أيضًا إلى اكتشاف مركبين دياز غير معروفين سابقًا، حمض 4-دياز-3-أوكسيبوتانويك وديازوأستون، اللذان تم تأكيدهما من خلال تخليق مركبات DBCO الخاصة بهما.
كما أوضح المؤلفون المسارات الحيوية المسؤولة عن إنتاج هذه المركبات الدياز من خلال تحديد والتحقق من مجموعات الجينات الحيوية في *N. ninae*. ومن الجدير بالذكر أن مجموعة الجينات dob كانت مرتبطة بتخليق المنتجات الدياز المحددة، حيث تم توصيف إنزيم Dob3 كإنزيم معدني فريد قادر على تحفيز أكسدة الهيدرازونات إلى مجموعات الدياز. تبرز هذه الدراسة إمكانيات الفحص القائم على التفاعل لكشف المستقلبات الحيوية النشطة الجديدة والإنزيمات الحيوية، مع التأكيد على التنوع البيئي والنسلي للميكروبات القادرة على إنتاج المنتجات الطبيعية المحتوية على الدياز. تشير النتائج إلى أن مثل هذه المستقلبات قد تلعب أدوارًا بيولوجية هامة، مما يستدعي المزيد من الاستكشاف لوظائفها وتطبيقاتها في اكتشاف الأدوية.
DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-025-10079-x
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41639443
Publication Date: 2026-02-04
Author(s): Katarina Pfeifer et al.
Primary Topic: Cyclopropane Reaction Mechanisms
Methods
In this section, the authors outline the methodologies employed in their experiments, emphasizing the synthesis and purification processes. Primer synthesis and DNA sequencing were conducted by Genewiz, while recombinant plasmid purification utilized the EZNA Plasmid DNA Mini Kit from Omega Bio-Tek. The study involved the use of restriction enzymes from New England Biolabs, with digestions performed according to established protocols. For assembly, the Gibson Master Mix was also sourced from New England Biolabs, and the corresponding assembly was executed following the manufacturer’s guidelines.
Additionally, the authors detail the materials used in their experiments, including Nickel nitriloacetic acid agarose (Ni-NTA) resin from Qiagen and Thermo Fisher Scientific, as well as various chemical reagents such as benzylidenehydrazine and NADPH. Protein concentrations were quantified by UV absorption at 280 nm using a Thermo Scientific NanoDrop 2000, with extinction coefficients calculated via ExPASy ProtParam. Optical densities of E. coli cultures were measured at 600 nm using a Beckman Coulter DU730 Life Sciences UV/Vis spectrophotometer. All experiments were conducted in biological triplicates, with data presented as individual points with error bars (± 1 standard deviation) or as representative results.
Discussion
In this study, the authors present a reactivity-based screening workflow aimed at discovering diazo-containing natural products, addressing the limitations of traditional natural product discovery methods that often overlook unstable compounds. By utilizing diazo functional groups as reactive handles for chemical derivatization, the researchers successfully identified and characterized novel metabolites from the bacterium *Nocardia ninae*. The workflow involved the use of dibenzocyclooctyne C-6 acid (DBCO-acid) to label diazo-containing metabolites, facilitating their detection through liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS). This approach not only enhanced the stability and detection of the metabolites but also led to the discovery of two previously unidentified diazo compounds, 4-diazo-3-oxobutanoic acid and diazoacetone, which were confirmed through synthesis of their DBCO adducts.
The authors further elucidated the biosynthetic pathways responsible for the production of these diazo compounds by identifying and validating the biosynthetic gene clusters in *N. ninae*. Notably, the dob gene cluster was linked to the biosynthesis of the identified diazo products, with the enzyme Dob3 being characterized as a unique metalloenzyme capable of catalyzing the oxidation of hydrazones to diazo groups. This study highlights the potential of reactivity-based screening to uncover novel bioactive metabolites and biosynthetic enzymes, emphasizing the ecological and phylogenetic diversity of microorganisms capable of producing diazo-containing natural products. The findings suggest that such metabolites may play significant biological roles, warranting further exploration of their functions and applications in drug discovery.