DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-025-59424-8
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40324996
تاريخ النشر: 2025-05-05
المؤلف: Yuwei Qin وآخرون
الموضوع الرئيسي: أبحاث البيولوجيا الجزيئية للنباتات
نظرة عامة
الساعة البيولوجية الوظيفية ضرورية لتكيف وبقاء الكائنات الحية، لا سيما في النباتات الأرضية حيث لا يزال التوصيف التفصيلي للتعبير الجيني اليومي على مستوى الخلية الواحدة غير مستكشف إلى حد كبير. تتناول هذه الدراسة هذه الفجوة من خلال استخدام تسلسل RNA أحادي النواة بتقنية الزمن المتقطع (snRNA-seq) على شتلات الأرابيدوبسيس، وجمع البيانات على مدى 48 ساعة بفواصل زمنية قدرها 4 ساعات ويوم واحد لمدة 24 ساعة بفواصل زمنية قدرها ساعتين، مما أسفر عن تحليل أكثر من 77,142 و130,000 نواة، على التوالي. تكشف النتائج أن أربعة تجمعات خلوية في الساق تظهر أنماط إيقاعية متماسكة، مع حوالي 3,000 جين يظهر تعبيرًا إيقاعيًا محددًا لنوع الخلية. ومن الجدير بالذكر أن الجينات الأساسية للساعة تتأرجح عبر أنواع خلايا متعددة، مما يشير إلى أن بيانات snRNA-seq يمكن أن تكون مفيدة في تحديد مكونات الساعة الإضافية التي تتأرجح بطريقة مستقلة عن الخلية.
علاوة على ذلك، تحدد الدراسة ABF1 كمنظم يومي، حيث يؤدي التعبير الزائد عنه إلى تقصير الفترة اليومية. توفر هذه الأبحاث مصدرًا شاملاً لفهم الإيقاع اليومي للنباتات على مستوى الخلية الواحدة، مما يبرز تعقيد الإيقاعات اليومية التي تختلف بين الأنسجة وأنواع الخلايا المختلفة. تعمل الساعة البيولوجية من خلال حلقات التغذية الراجعة النسخية والترجمية (TTFLs)، مما ينظم التعبير الجيني بما يتماشى مع الدورات البيئية، وهو أمر حاسم للتنظيم الزمني للعمليات الفسيولوجية في النباتات.
طرق
في هذه الدراسة، تم تعديل الطرق المستخدمة في زراعة النباتات وجمع المواد من البروتوكولات التي تم وضعها مسبقًا. الكائن النموذجي المستخدم كان نوع كولومبيا-0 من الأرابيدوبسيس ثاليانا. تم إنبات البذور على أطباق أجار مرشيغ وسكوج (MS) المضافة إليها 3% سكروز، تلاها فترة تقسية لمدة يومين عند 4 درجات مئوية. بعد ذلك، نمت النباتات في ظروف محكومة عند 22 درجة مئوية تحت فترة ضوء لمدة 12 ساعة وظلام لمدة 12 ساعة (12 L/12D) مع كثافة ضوء قدرها 100 ميكرومول م\(^{-2}\) ث\(^{-1}\).
بعد أسبوع من التكيف، تم تحويل النباتات إلى ظروف ضوء ثابت، مع الحفاظ على نفس كثافة الضوء. تم جمع مواد النباتات على فترات زمنية قدرها ساعتين على مدى 24 ساعة وعلى فترات زمنية قدرها أربع ساعات على مدى 48 ساعة، بدءًا من الفجر الذاتي في اليوم التاسع من دورة النمو. تم تصميم جدول جمع المواد هذا لالتقاط التغيرات الزمنية في الاستجابات الفسيولوجية للنباتات.
نتائج
تظهر النتائج من تسلسل RNA أحادي النواة (snRNA-seq) لشتلات الأرابيدوبسيس وجود إيقاعات يومية في تراكم mRNA. باستخدام منصة 10X Genomics، أنتجت الدراسة مجموعات بيانات واسعة، بما في ذلك 131,152 نواة على مدى 24 ساعة و77,142 نواة على مدى 48 ساعة، مما يعكس أنماط التعبير الإيقاعي عبر 24,503 و28,813 جين، على التوالي. ومن الجدير بالذكر أن الجينات الأساسية للساعة أظهرت تذبذبات قوية، مما يؤكد فعالية المنهجية في تحليل الديناميات اليومية. كشفت التحليلات عن تشابهات بارزة في النسخ بين النقاط الزمنية المتجاورة، مما يشير إلى تأثير الإيقاعات اليومية على التعبير الجيني.
لمعالجة التحديات المحتملة في التجميع بسبب التأثيرات اليومية، قام المؤلفون بتقييم خمس استراتيجيات لدمج البيانات، واختاروا في النهاية طريقة توازن بشكل فعال بين الحفاظ على التباين البيولوجي وإزالة تأثير الدفعة. أدت هذه الطريقة إلى تحديد 40 تجمعًا متميزًا في مجموعة بيانات الـ 48 ساعة و27 تجمعًا في مجموعة بيانات الـ 24 ساعة، مع تعليقات بناءً على التعبير الجيني المحدد لكل تجمع والتداخل مع مجموعات البيانات الموجودة. نجحت الدراسة في تصنيف أنواع خلايا مختلفة، بما في ذلك الميزوفيل، والثغور، والأنسجة الوعائية، بينما حددت أيضًا تجمعات غير موصوفة سابقًا، مما يعزز فهم التباين الخلوي في شتلات الأرابيدوبسيس.
مناقشة
في هذه الدراسة، بحثنا في التعبير عن الجينات المنظمة للساعة البيولوجية عبر أنواع خلايا مختلفة في الأرابيدوبسيس، باستخدام بيانات من مجموعتين من البيانات بدقة زمنية قدرها 24 ساعة و48 ساعة. كشفت تحليلاتنا أن حوالي 40% من 13,256 جينًا تم تحديدها كمنظمة للساعة أظهرت تراكمًا إيقاعيًا للنسخ، مع انتشار ملحوظ في تجمعات الساق مقارنة بتجمعات الجذر. على وجه الخصوص، أظهرت خلايا الميزوفيل عددًا كبيرًا من الجينات المتأرجحة، مما يشير إلى تنظيم معقد خاص بالنسيج للإيقاعات اليومية. كما حددنا مجموعة من الجينات المعبر عنها بشكل مستقر عبر جميع أنواع الخلايا، والتي يمكن أن تكون مرجعًا للتجارب المستقبلية.
أظهر الفحص الإضافي للجينات الأساسية للساعة، مثل CCA1 وTOC1، أنماط تذبذب متميزة عبر أنواع خلايا مختلفة، مما يبرز تباين التنظيم اليومي. ومن الجدير بالذكر أننا لاحظنا تحولات في المرحلة في التعبير الجيني، لا سيما في خلايا البشرة للساق، مما يشير إلى أن الساعة البيولوجية تعمل بشكل مختلف عبر أنواع الخلايا. تؤكد نتائجنا على الطبيعة متعددة المذبذبات لشبكة الساعة البيولوجية للنبات وتوفر أطلسًا شاملاً للإيقاعات اليومية المحددة لنوع الخلية. بالإضافة إلى ذلك، أنشأنا موردًا عبر الإنترنت للوصول إلى بيانات التعبير الجيني، مما يسهل المزيد من الأبحاث في علم الأحياء الزمنية للنباتات وقد يُفيد في الممارسات الزراعية.
DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-025-59424-8
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40324996
Publication Date: 2025-05-05
Author(s): Yuwei Qin et al.
Primary Topic: Plant Molecular Biology Research
Overview
The functional circadian clock is essential for the adaptation and survival of organisms, particularly in land plants where the detailed profiling of circadian gene expression at the single-cell level remains largely unexplored. This study addresses this gap by employing time-lapse single-nucleus RNA sequencing (snRNA-seq) on Arabidopsis seedlings, collecting data over a 48-hour period at 4-hour intervals and a 24-hour day at 2-hour intervals, resulting in over 77,142 and 130,000 nuclei analyzed, respectively. The findings reveal that four cell clusters in the shoot exhibit coherent rhythmic patterns, with approximately 3,000 genes demonstrating cell-type specific rhythmic expression. Notably, core clock genes oscillate across multiple cell types, indicating that the snRNA-seq data can be instrumental in identifying additional clock components that oscillate in a cell-autonomous manner.
Furthermore, the study identifies ABF1 as a circadian regulator, whose overexpression leads to a shortened circadian period. This research provides a comprehensive resource for understanding plant circadian rhythmicity at the single-cell level, highlighting the complexity of circadian rhythms that vary among different tissues and cell types. The circadian clock operates through transcriptional-translational feedback loops (TTFLs), regulating gene expression in alignment with environmental cycles, which is crucial for the temporal organization of physiological processes in plants.
Methods
In this study, the methods employed for plant growth and material harvesting were adapted from previously established protocols. The model organism used was the Columbia-0 ecotype of Arabidopsis thaliana. Seeds were germinated on Murashige and Skoog (MS) agar plates supplemented with 3% sucrose, followed by a 2-day stratification period at 4 °C. Subsequently, the plants were grown in controlled conditions at 22 °C under a 12-hour light and 12-hour dark photoperiod (12 L/12D) with a light intensity of 100 μmol m\(^{-2}\) s\(^{-1}\).
After a week of entrainment, the plants were transitioned to constant light conditions, maintaining the same light intensity. Harvesting of plant materials occurred at two-hour intervals over a 24-hour period and at four-hour intervals over a 48-hour period, commencing from subjective dawn on day 9 of the growth cycle. This systematic harvesting schedule was designed to capture temporal variations in the physiological responses of the plants.
Results
The results from the single-nucleus RNA sequencing (snRNA-seq) of Arabidopsis seedlings demonstrate the presence of circadian rhythms in mRNA accumulation. Utilizing the 10X Genomics platform, the study generated extensive datasets, including 131,152 nuclei over 24 hours and 77,142 nuclei over 48 hours, capturing rhythmic expression patterns across 24,503 and 28,813 genes, respectively. Notably, core clock genes exhibited robust oscillations, confirming the methodology’s effectiveness in analyzing circadian dynamics. The analysis revealed pronounced transcriptomic similarities between adjacent time points, indicating the influence of circadian rhythms on gene expression.
To address potential clustering challenges due to circadian effects, the authors evaluated five data integration strategies, ultimately selecting a method that effectively balanced biological variability preservation and batch effect removal. This approach led to the identification of 40 distinct clusters in the 48-hour dataset and 27 clusters in the 24-hour dataset, with annotations based on cluster-specific gene expression and overlap with existing datasets. The study successfully classified various cell types, including mesophyll, stomata, and vascular tissues, while also identifying previously unannotated clusters, thereby enhancing the understanding of cellular heterogeneity in Arabidopsis seedlings.
Discussion
In this study, we investigated the expression of circadian clock-regulated genes across various cell types in Arabidopsis, utilizing data from two datasets with 24-hour and 48-hour time resolutions. Our analysis revealed that approximately 40% of the 13,256 identified clock-regulated genes exhibited rhythmic transcript accumulation, with a notable prevalence in shoot clusters compared to root clusters. Specifically, mesophyll cells showed a high number of oscillating genes, indicating a complex tissue-specific regulation of circadian rhythms. We also identified a subset of stably expressed genes across all cell types, which could serve as references for future experiments.
Further examination of core clock genes, such as CCA1 and TOC1, demonstrated distinct oscillation patterns across different cell types, highlighting the heterogeneity of circadian regulation. Notably, we observed phase shifts in gene expression, particularly in shoot epidermal cells, suggesting that the circadian clock operates differently across cell types. Our findings underscore the multi-oscillator nature of the plant circadian network and provide a comprehensive atlas of cell-type-specific circadian rhythms. Additionally, we established an online resource for accessing gene expression data, facilitating further research in plant chronobiology and potentially informing agricultural practices.