DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-025-33917-4
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41698961
تاريخ النشر: 2026-02-16
المؤلف: Anne Caroline Mascarenhas dos Santos وآخرون
الموضوع الرئيسي: أبحاث العدوى الفيروسية التنفسية
نظرة عامة
تدرس الدراسة فعالية تسلسل الميتاجينوم غير المستهدف في تحديد مسببات الأمراض التنفسية، لا سيما في العينات التي اختبرت سلبية للاختبارات التشخيصية الشائعة مثل لوحة التنفس BioFire و SARS-CoV-2. من خلال تحليل 305 عينات سلبية سابقًا و 26 عينة إيجابية، تمكن الباحثون من تحديد الفيروسات التنفسية البشرية في 16 من العينات السلبية (5%)، حيث كانت فيروس الإنفلونزا C، فيروس بوكافيروس البشري، فيروس الأنف A و C، و SARS-CoV-2 هي الأكثر انتشارًا. بالإضافة إلى ذلك، تم استرداد الجينومات التوافقية لـ 14 فيروسًا، مما يكشف عن سلالات مرتبطة ارتباطًا وثيقًا، بينما أظهرت 21 عينة نوعًا بكتيريًا أو فطريًا سائدًا.
تسلط النتائج الضوء على قيود اختبارات تضخيم الحمض النووي الروتينية (NAATs)، التي، على الرغم من كونها سريعة وفعالة من حيث التكلفة، غالبًا ما تفشل في اكتشاف مسببات الأمراض الجديدة أو النادرة وسلالات معينة من الفيروسات المتنوعة. بالمقابل، يوفر تسلسل الميتاجينوم غير المستهدف نهجًا غير موجه لمسببات الأمراض، مما يمكّن من اكتشاف كل من مسببات الأمراض المعروفة والناشئة، إلى جانب التحليل الجيني لتوصيف السلالات وعلامات مقاومة الأدوية. على الرغم من أن تسلسل الميتاجينوم أكثر تعقيدًا وتكلفة، تشير الدراسة إلى أن استخدام لوحة تسلسل واسعة النطاق يمكن أن يعزز الحساسية واسترداد الجينوم. يدعو المؤلفون إلى دمج تسلسل الميتاجينوم في استراتيجيات الصحة العامة، لا سيما للحالات السلبية لـ NAAT المرتبطة بأمراض شديدة أو تفشيات، مع توقع أن تؤدي التطورات التكنولوجية في النهاية إلى خفض التكاليف وتبسيط سير العمل.
مقدمة
تسلط المقدمة الضوء على التأثير الكبير لمسببات الأمراض التنفسية، التي تمثل حوالي 12.8 مليار حالة جديدة من التهابات الجهاز التنفسي العلوي على مستوى العالم في عام 2021. حفزت جائحة COVID-19 جهود المراقبة المعززة، مع التركيز بشكل أساسي على استخدام طرق qPCR و PCR التي تركز على مسببات الأمراض السائدة مثل SARS-CoV-2، الإنفلونزا A، وفيروس الجهاز التنفسي المخلوي (RSV). بينما قدمت مراقبة مياه الصرف الصحي رؤى حول مسببات الأمراض المتداولة، إلا أنها محدودة بقدرة الكشف عن بعض مسببات الأمراض في مياه الصرف الصحي. استهدفت المراقبة السريرية التقليدية بشكل أساسي مسببات الأمراض الشائعة، مما قد يتسبب في تجاهل تلك النادرة أو الأكثر تباينًا.
استجابةً لهذه القيود، زادت تطبيقات تسلسل الميتاجينوم والميتارنسكريبتوم غير المستهدف في التهابات الجهاز التنفسي. تشمل التطورات الحديثة سير العمل السريرية المعتمدة ولوحات تسلسل التقاط البروب التي تعزز حساسية الكشف عن الفيروسات. على الرغم من وعد الميتاجينوم بتوصيف شامل لمسببات الأمراض، فإن تكلفته العالية قد قيدت تطبيقه الأوسع خارج SARS-CoV-2. تم إنشاء نظام مراقبة SARS-CoV-2 وفيروسات الجهاز التنفسي في كاليفورنيا (CalSRVSS) لاختبار الأفراد الذين تظهر عليهم أعراض عبر كاليفورنيا، مما أسفر عن عدد كبير من العينات، العديد منها كانت سلبية لمسببات الأمراض الشائعة. تستفيد هذه الدراسة من مجموعة من هذه العينات السلبية للتسلسل غير المستهدف لاستكشاف وجود مسببات الأمراض الأقل تعرفًا المرتبطة بالأعراض التنفسية، مع الإبلاغ عن تكرار مسببات الأمراض المحتملة المكتشفة.
الطرق
في هذا القسم، قام المؤلفون بتقييم الطرق المستخدمة لتسلسل العينات الفيروسية وحددوا التباينات بين نتائج التسلسل والاختبارات التشخيصية السابقة التي أجريت باستخدام BioFire و SARS-CoV-2. من بين 31 اكتشافًا فيروسيًا متوقعًا من عينات إيجابية سابقة، لم يتم تحديد 8 منها بواسطة التسلسل غير المستهدف أو المستهدف. يقترح المؤلفون أن عوامل مثل التخزين المطول للعينات (حتى 43 شهرًا)، دورات التجميد والذوبان، وانخفاض التركيزات الأولية للأحماض النووية الفيروسية قد تكون قد ساهمت في انخفاض حساسية طرق التسلسل. علاوة على ذلك، تم أيضًا النظر في إمكانية النتائج الإيجابية الكاذبة من الاختبارات السابقة.
بالإضافة إلى ذلك، كشفت الدراسة عن عينات إيجابية غير متوقعة لـ SARS-CoV-2، والتي تم اكتشافها من خلال التحليل القائم على التسلسل. تشير النتائج إلى أن هذه التسلسلات الفيروسية قد تكون قابلة للتحديد باستخدام طرق RT-PCR التابعة لمراكز السيطرة على الأمراض، مما يسلط الضوء على القيود المحتملة في الأساليب التشخيصية الأولية وأهمية التسلسل للكشف الدقيق عن الفيروسات.
النتائج
في هذه الدراسة، تم تسلسل 305 عينات تنفسية سلبية لـ BioFire لتحديد مسببات الأمراض الأقل شيوعًا التي لا تغطيها لوحة مسببات الأمراض التنفسية لـ BioFire. تم جمع هذه العينات من أفراد يظهرون أعراض تنفسية عبر خمس مقاطعات في كاليفورنيا من يوليو 2020 إلى ديسمبر 2022. بالإضافة إلى ذلك، تم تحليل 26 عينة فيروسية إيجابية معروفة، بما في ذلك تلك الناتجة عن إعادة العدوى بـ SARS-CoV-2. أسفر تسلسل Illumina غير المستهدف عن متوسط 10.8 مليون قراءة لكل عينة، بينما أسفر تعزيز التقاط البروب على مجموعة فرعية من 78 عينة عن متوسط 4.9 مليون قراءة.
أشارت النتائج إلى أن غالبية قراءات التسلسل غير المستهدف نشأت من المضيف البشري، مع هيمنة التسلسلات البكتيرية والتسلسلات غير المصنفة بعد إزالة قراءات المضيف. على وجه التحديد، عند حد أدنى صارم لطول الضربة يبلغ 40 نيوكليوتيد، ظلت نسبة كبيرة من التسلسلات غير المستهدفة غير مصنفة، بينما عند عتبة أكثر تساهلاً تبلغ 15 نيوكليوتيد، كانت 6% فقط غير مصنفة. بالمقابل، أسفر التسلسل المستهدف عبر تعزيز التقاط البروب عن نسبة أعلى من القراءات الفيروسية، لا سيما في مجموعة العينات الإيجابية السابقة، مما يبرز فعالية هذه الطريقة في الكشف عن مسببات الأمراض الفيروسية.
المناقشة
في هذه الدراسة، أجرى الباحثون تحليلًا ميتاجينوميًا شاملاً لـ 305 عينات مسحة أنفية بلعومية غير محددة من مرضى يعانون من أعراض عدوى الجهاز التنفسي العلوي، تم جمعها كجزء من نظام مراقبة SARS-CoV-2 وفيروسات الجهاز التنفسي في كاليفورنيا. كانت العينات سلبية في البداية لـ SARS-CoV-2 ومسببات الأمراض الشائعة الأخرى ولكن تم إخضاعها لتسلسل غير مستهدف ومستهدف لتحديد مسببات الأمراض الفيروسية والبكتيرية والفطرية. من الجدير بالذكر أن 5% من العينات السلبية السابقة اختبرت إيجابية لمسببات الأمراض الفيروسية، بما في ذلك فيروس الإنفلونزا C وفيروس الأنف، بينما أظهرت 12% وجود بكتيريا أو فطريات. سلطت الدراسة الضوء على إمكانية اكتشاف العدوى المشتركة والتحديات في تفسير الأهمية السريرية للميكروبات المحددة، لا سيما مسببات الأمراض الانتهازية.
تؤكد النتائج على فائدة تسلسل الميتاجينوم كأداة مكملة لاختبارات تضخيم الحمض النووي التقليدية (NAATs)، لا سيما في الحالات التي تسفر فيها NAATs عن نتائج سلبية على الرغم من الشك السريري في العدوى. أظهر الباحثون أن تعزيز التقاط البروب حسّن بشكل كبير من استرداد الجينومات الفيروسية، مما يشير إلى أن هذه الطريقة يمكن أن تعزز مراقبة مسببات الأمراض والتحقيقات في التفشيات. ومع ذلك، اعترفت الدراسة أيضًا بالقيود، مثل إمكانية انخفاض تركيزات الحمض النووي لمسببات الأمراض والتعقيدات المرتبطة بسير العمل الميتاجينومي، والتي قد تعيق التطبيق السريري الروتيني. بشكل عام، تدعو الأبحاث إلى دمج الأساليب الميتاجينومية في استراتيجيات الصحة العامة لفهم أفضل والاستجابة للعدوى التنفسية.
القيود
في تحليلنا الميتاجينومي، نجحنا في تحديد فيروس الإنفلونزا C وفيروس بوكافيروس البشري 1 من عينات اعتبرت سابقًا سلبية. تتماشى هذه النتائج مع الدراسات الوبائية الحديثة التي تشير إلى أن كلا الفيروسين شائعان، لا سيما بين الأطفال، ومع ذلك، لا يتم تضمينهما عادةً في لوحات الاختبار التنفسية القياسية. تشير بياناتنا إلى أن كلا الفيروسين قد انتشرا على نطاق واسع داخل كاليفورنيا، كما يتضح من التشابهات الجينية للسلالات المحددة والتوزيع الجغرافي للعينات.
ومع ذلك، فإن الكشف عن فيروس بوكافيروس البشري 1 يتطلب تفسيرًا دقيقًا. من المعروف أن هذا الفيروس يستمر في الجهاز التنفسي لفترة طويلة بعد المرحلة الحادة من العدوى وقد وُجد في أفراد أصحاء، غالبًا كعدوى مشتركة مع مسببات أمراض أخرى. من المهم أن تحليلنا لم يكشف عن أي مسببات أمراض فيروسية إضافية في العينات، على الرغم من أن الأدبيات الحالية تشير إلى أن بوكافيروس يمكن أن يظهر أعراض تنفسية بشكل مستقل. تبرز هذه القيود الحاجة إلى مزيد من البحث لتوضيح الأهمية السريرية لهذه الاكتشافات الفيروسية.
DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-025-33917-4
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41698961
Publication Date: 2026-02-16
Author(s): Anne Caroline Mascarenhas dos Santos et al.
Primary Topic: Respiratory viral infections research
Overview
The study investigates the efficacy of untargeted metagenomic sequencing in identifying respiratory pathogens, particularly in samples that tested negative for common diagnostic tests like the BioFire Respiratory Panel (RP) and SARS-CoV-2. By analyzing 305 previously negative samples and 26 positive samples, the researchers successfully identified human respiratory viruses in 16 of the negative samples (5%), with Influenza C virus, Human Bocavirus, Rhinovirus A and C, and SARS-CoV-2 being the most prevalent. Additionally, consensus genomes were recovered for 14 viruses, revealing closely related strains, while 21 samples showed a predominant bacterial or fungal species.
The findings highlight the limitations of routine nucleic acid amplification tests (NAATs), which, while rapid and cost-effective, often fail to detect novel or rare pathogens and specific strains of diverse viruses. In contrast, untargeted metagenomic sequencing offers a pathogen-agnostic approach, enabling the detection of both known and emerging pathogens, alongside genetic analysis for strain characterization and drug resistance markers. Although metagenomic sequencing is more complex and costly, the study suggests that employing a broad probe-capture sequencing panel can enhance sensitivity and genome recovery. The authors advocate for the integration of metagenomic sequencing into public health strategies, particularly for NAAT-negative cases associated with severe illnesses or outbreaks, anticipating that advancements in technology will eventually reduce costs and streamline workflows.
Introduction
The introduction highlights the significant impact of respiratory pathogens, which accounted for an estimated 12.8 billion new upper respiratory infections globally in 2021. The COVID-19 pandemic catalyzed enhanced surveillance efforts, primarily utilizing qPCR and PCR-based methods focused on prevalent pathogens such as SARS-CoV-2, influenza A, and respiratory syncytial virus (RSV). While wastewater surveillance has offered insights into circulating pathogens, it is limited by the detectability of certain pathogens in wastewater. Traditional clinical surveillance has predominantly targeted common pathogens, potentially overlooking rarer or more divergent ones.
In response to these limitations, there has been a rise in the application of untargeted metagenomic and metatranscriptomic sequencing for respiratory infections. Recent advancements include validated clinical workflows and commercial probe-capture sequencing panels that enhance viral detection sensitivity. Despite the promise of metagenomics for comprehensive pathogen characterization, its high cost has restricted broader application beyond SARS-CoV-2. The California SARS-CoV-2 and Respiratory Virus Surveillance System (CalSRVSS) was established to test symptomatic individuals across California, yielding a substantial number of samples, many of which were negative for common pathogens. This study leverages a selection of these negative samples for untargeted sequencing to explore the presence of less recognized pathogens associated with respiratory symptoms, reporting on the frequency of potential pathogens detected.
Methods
In this section, the authors evaluated the methods used for sequencing viral samples and identified discrepancies between sequencing results and prior diagnostic tests conducted using BioFire and SARS-CoV-2 assays. Out of 31 expected viral detections from previously positive samples, 8 were not identified by either untargeted or targeted sequencing. The authors suggest that factors such as prolonged sample storage (up to 43 months), freeze-thaw cycles, and low initial concentrations of viral nucleic acids may have contributed to the reduced sensitivity of the sequencing methods. Furthermore, the possibility of false-positive results from earlier tests was also considered.
Additionally, the study uncovered unexpected positive samples for SARS-CoV-2, which were detected through sequence-based analysis. The findings imply that these viral sequences might have been identifiable using the CDC RT-PCR methods, highlighting potential limitations in the initial diagnostic approaches and the importance of sequencing for accurate viral detection.
Results
In this study, 305 BioFire-negative respiratory samples were sequenced to identify less common pathogens not covered by the BioFire Respiratory Pathogens panel. These samples were collected from individuals exhibiting respiratory symptoms across five counties in California from July 2020 to December 2022. Additionally, 26 known viral positive samples, including those from SARS-CoV-2 reinfections, were analyzed. The untargeted Illumina sequencing yielded an average of 10.8 million reads per sample, while probe-capture enrichment on a subset of 78 samples produced an average of 4.9 million reads.
The results indicated that the majority of untargeted sequencing reads originated from the human host, with bacterial sequences and unclassified sequences predominating after host reads were removed. Specifically, at a stringent minimum hit length of 40 nucleotides, a significant portion of the untargeted sequences remained unclassified, while at a more lenient threshold of 15 nucleotides, only 6% were unclassified. Conversely, targeted sequencing via probe-capture enrichment resulted in a higher proportion of viral reads, particularly in the subset of previous positive samples, highlighting the effectiveness of this method in detecting viral pathogens.
Discussion
In this study, the researchers conducted a comprehensive metagenomic analysis of 305 de-identified nasopharyngeal swab samples from patients with upper respiratory tract infection symptoms, collected as part of the California SARS-CoV-2 and Respiratory Virus Surveillance System. The samples were initially negative for SARS-CoV-2 and other common pathogens but were subjected to untargeted and targeted sequencing to identify viral, bacterial, and fungal pathogens. Notably, 5% of previously negative samples tested positive for viral pathogens, including Influenza C virus and Rhinovirus, while 12% showed bacterial or fungal presence. The study highlighted the potential for detecting co-infections and the challenges in interpreting the clinical significance of identified microorganisms, particularly opportunistic pathogens.
The findings underscore the utility of metagenomic sequencing as a complementary tool to traditional nucleic acid amplification tests (NAATs), particularly in cases where NAATs yield negative results despite clinical suspicion of infection. The researchers demonstrated that probe-capture enrichment significantly improved the recovery of viral genomes, suggesting that this method could enhance pathogen surveillance and outbreak investigations. However, the study also acknowledged limitations, such as the potential for low pathogen nucleic acid concentrations and the complexities associated with metagenomic workflows, which may hinder routine clinical application. Overall, the research advocates for the integration of metagenomic approaches in public health strategies to better understand and respond to respiratory infections.
Limitations
In our metagenomic analysis, we successfully identified Influenza C virus and Human Bocavirus 1 from samples previously deemed negative. These findings align with recent epidemiological studies indicating that both viruses are prevalent, particularly among children, yet they are not typically included in standard respiratory testing panels. Our data suggest that both viruses have circulated widely within California, as evidenced by the genetic similarities of the identified strains and the geographic distribution of the samples.
However, the detection of Human Bocavirus 1 warrants careful interpretation. This virus is known to persist in the respiratory tract long after the acute phase of infection and has been found in healthy individuals, often as a coinfection with other pathogens. Importantly, our analysis did not reveal any additional viral pathogens in the samples, although existing literature suggests that Bocavirus can manifest respiratory symptoms independently. These limitations highlight the need for further research to clarify the clinical significance of these viral detections.