DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-026-69855-6
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41857032
تاريخ النشر: 2026-03-19
المؤلف: Bing He وآخرون
الموضوع الرئيسي: هيكل البروتين والديناميات
نظرة عامة
تتناول الأبحاث التحدي المستمر المتمثل في التوفيق بين النمذجة الحسابية والنتائج التجريبية في هندسة البروتينات. يقدم المؤلفون ORI (تكرار تعزيز الأنطولوجيا)، وهو إطار قابل للتوسع يجمع بين فك التشفير المشروط بالأنطولوجيا مع التعلم المعزز من التغذية الراجعة التجريبية (RLWF). تستخدم هذه الطريقة المبتكرة الأنطولوجيات المنظمة لفرض قيود متعددة المستويات، مما يسهل توليد متغيرات بروتينية قابلة للتحكم وقابلة للتفسير. يعمل الإطار من خلال عملية تكرارية مغلقة تشمل التوليد، والقياس التجريبي، وتحديث النموذج، مما يسمح بالتحسين المستمر المتماشي مع الأهداف الواقعية.
تظهر القابلية العملية لـ ORI من خلال مهام متنوعة، بما في ذلك تحسين النشاط الإنزيمي، وتعزيز الاستقرار الحراري، وهندسة البروتينات متعددة الوظائف. ومن الجدير بالذكر أن الإطار نجح في هندسة متغيرات بروتينية تفوقت بشكل كبير على المعايير الطبيعية، مثل متغير الليزوزيم الذي يظهر زيادة بمقدار 100 ضعف في النشاط، وإنزيم الكيتيناز المستقر عند 85 درجة مئوية، وإنزيمات ذات وظائف مزدوجة قادرة على أداء كل من نشاط الليزوزيم والكيتيناز. هذه النتائج تضع ORI كمنصة قوية لهندسة البروتينات متعددة الأهداف بكفاءة في السياقات التجريبية.
الطرق
في هذا القسم، يصف المؤلفون نهج هندسة البروتينات ذو الحلقة المغلقة الذي يدمج التغذية الراجعة التجريبية لتعزيز أداء نظام ORI. من خلال جمع البيانات حول مستويات التعبير البروتيني والنشاط الإنزيمي من التجارب الأولية في المختبر، استخدموا التعلم المعزز من التغذية الراجعة في المختبر (RLWF) لتحسين وحدة توليد البروتين (PGM). أدى هذا التحسين إلى توليد 10,000 بروتين إضافي، مما نتج عنه زيادة كبيرة في متوسط درجة pLDDT من حوالي 75 إلى 85، مما يشير إلى تحسين الثقة الهيكلية والصلابة. أظهرت التجارب اللاحقة في المختبر أن البروتينات المصممة باستخدام النموذج المحسن أظهرت مستويات تعبير أعلى عبر عائلات إنزيمية متنوعة، مع زيادة ملحوظة في مستويات التعبير المتوسطة لإنزيم الجلوكوزامينيداز، وإنزيم النقل الجليكوزي، والليزوزيم الفيروسي.
علاوة على ذلك، قام المؤلفون بتقييم الوظيفة الإنزيمية للبروتينات المختارة، كاشفين أن 13 من أصل 20 بروتينًا تم اختبارها تجاوزت نشاط تصميم عالي الأداء من النموذج الأصلي، مع إظهار التصميم الأعلى زيادة ملحوظة بمقدار 66 ضعفًا في نشاط الليزوزيم. أظهرت المقارنة مع النماذج المعتمدة مثل ProGen3 وEvo2 وProteinMPNN وRosetta فعالية نظام ORI في توليد بروتينات ذات تعبير وأداء إنزيمي متفوق. بشكل عام، أثبت دمج التغذية الراجعة التجريبية في إطار ORI أنه استراتيجية ناجحة لتحسين تصميم البروتين بشكل تكراري، مما أدى إلى تحسين النتائج الوظيفية.
النتائج
تتناول قسم النتائج تطوير ووظائف إطار ORI، وهو نظام حسابي مغلق مصمم لهندسة البروتينات الوظيفية. يتكون ORI من ثلاثة مكونات متكاملة: وكيل توليد البروتين (PGA)، ونموذج توليد البروتين المدرك للوظيفة (PGM)، ونموذج التسلسل الموحد (USM). يقوم PGA، باستخدام نموذج لغة ذاتية التطور مع 2 مليار معلمة، بتحويل أوصاف وظائف البروتين المحددة من قبل المستخدم إلى مطالبات أنطولوجية منظمة، مما يوجه PGM في توليد تسلسلات البروتين المرشحة. يتعلم PGM، وهو نموذج تلقائي الانحدار مع 3 مليارات معلمة، العلاقات المعقدة بين تسلسلات البروتينات والهياكل والوظائف من خلال نظام أنطولوجيا بروتينية موحد، والذي يدمج بيانات واسعة من مصادر مثل UniProt وSCOPe.
يقوم USM بتقييم تسلسلات البروتين المولدة، متنبئًا بخصائصها مثل الاستقرار الحراري والذوبانية، ويقوم بتصفية هذه التسلسلات بناءً على متطلبات المستخدم. ومن الجدير بالذكر أن نموذج USM، الذي يحتوي على 100 مليون معلمة، يظهر كفاءة حسابية ودقة متفوقة مقارنة بالنماذج الموجودة، محققًا معايير أداء كبيرة في توقع خصائص البروتين. كما يدمج الإطار التعلم المعزز من التغذية الراجعة في المختبر (RLWF) لتحسين PGA وPGM بشكل تكراري بناءً على النتائج التجريبية، مع معالجة التحديات مثل انحياز الطول في توليد التسلسلات من خلال وظيفة خسارة R-DPO المبتكرة. يعزز هذا النهج المنهجي جودة ووظائف البروتينات المولدة، مما يسهل هندسة البروتينات بكفاءة عبر أهداف تجريبية متنوعة.
المناقشة
يقدم قسم المناقشة في ورقة البحث قدرات وفعالية إطار ORI في هندسة البروتينات ذات الأنشطة الشبيهة بالإنزيم، والاستقرار الحراري، ومتعددة الوظائف. توضح الدراسة أن ORI يمكن أن تولد مجموعة متنوعة من تسلسلات البروتين المرشحة، محققة هوية تسلسل متوسطة تبلغ 0.96 مع الإنزيمات المعروفة، بينما تكشف أيضًا عن ارتباط ضعيف بين الهويات التسلسلية والهيكلية. يشير هذا إلى أن كلا المقياسين ضروريان لتقييم البروتينات المهندسة. يعزز خط أنابيب ORI بشكل كبير نسبة المرشحين الذين يمتلكون مجالات وظيفية مرغوبة من 45.89% إلى 98.91% بعد مراقبة الجودة، مما يبرز فائدة نموذج التسلسل الموحد (USM) في توقع الميزات الوظيفية.
علاوة على ذلك، أظهرت التحقق التجريبي من 100 مرشح لليزوزيم معدلات نجاح تعبير مقارنة مع الإنزيمات الطبيعية، مع بعض المتغيرات، مثل TX-L6، التي تظهر نشاطًا متفوقًا. كما نجح الإطار في تصميم بروتينات شبيهة بالكيتيناز ذات استقرار حراري، مع احتفاظ العديد منها بالنشاط الكامل عند درجات حرارة مرتفعة، مما يوسع نطاق تشغيلها. بالإضافة إلى ذلك، سهل ORI تصميم إنزيمات متعددة الوظائف، حيث تفوق المرشح الأعلى، TX-ME، على كل من الإنزيمات أحادية الوظيفة ونظيراتها الطبيعية ذات الوظائف المزدوجة. بشكل عام، تؤكد النتائج على إمكانيات ORI كمنصة متعددة الاستخدامات لهندسة البروتينات، القادرة على تلبية متطلبات وظيفية معقدة دون الاعتماد على قوالب هيكلية محددة مسبقًا.
DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-026-69855-6
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41857032
Publication Date: 2026-03-19
Author(s): Bing He et al.
Primary Topic: Protein Structure and Dynamics
Overview
The research addresses the persistent challenge of reconciling computational modeling with experimental outcomes in protein engineering. The authors introduce ORI (Ontology Reinforcement Iteration), a scalable framework that combines ontology-conditioned decoding with reinforcement learning from experimental feedback (RLWF). This innovative approach utilizes structured ontologies to impose multi-level constraints, facilitating the generation of controllable and interpretable protein variants. The framework operates through a closed-loop iterative process that encompasses generation, experimental measurement, and model updating, allowing for continuous optimization aligned with real-world objectives.
The practical applicability of ORI is demonstrated through various tasks, including the optimization of enzymatic activity, enhancement of thermal stability, and multifunctional protein engineering. Notably, the framework successfully engineered protein variants that significantly outperformed natural baselines, such as a lysozyme variant exhibiting a 100-fold increase in activity, a chitinase stable at 85 °C, and dual-function enzymes capable of both lysozyme and chitinase activities. These findings position ORI as a robust platform for efficient, multi-objective protein engineering in experimental contexts.
Methods
In this section, the authors describe a closed-loop protein engineering approach that integrates experimental feedback to enhance the performance of the ORI system. By collecting data on protein expression levels and enzymatic activity from initial wet-lab assays, they employed reinforcement learning from wet-lab feedback (RLWF) to optimize the protein generation module (PGM). This optimization led to the generation of an additional 10,000 proteins, resulting in a significant increase in the median pLDDT score from approximately 75 to 85, indicating improved structural confidence and robustness. Subsequent wet-lab assays demonstrated that proteins designed using the optimized model exhibited higher expression levels across various enzyme families, with median expression levels increasing significantly for glucosaminidase, transglycosylase, and phage lysozyme.
Furthermore, the authors assessed the enzymatic function of selected proteins, revealing that 13 out of 20 tested proteins surpassed the activity of a high-performing design from the original model, with the top design showing a remarkable 66-fold increase in lysozyme activity. Benchmarking against established models such as ProGen3, Evo2, ProteinMPNN, and Rosetta highlighted the effectiveness of the ORI system in generating proteins with superior expression and enzymatic performance. Overall, the integration of experimental feedback into the ORI framework proved to be a successful strategy for iteratively refining protein design, leading to enhanced functional outcomes.
Results
The Results section details the development and functionality of the ORI framework, a closed-loop computational system designed for functional protein engineering. ORI comprises three integrated components: a Protein Generation Agent (PGA), a Function-aware Protein Generation Model (PGM), and a Unified Sequence Model (USM). The PGA, utilizing a self-evolving language model with 2 billion parameters, converts user-defined protein function descriptions into structured ontology prompts, guiding the PGM in generating candidate protein sequences. The PGM, an autoregressive model with 3 billion parameters, learns the complex relationships between protein sequences, structures, and functions through a unified protein ontology system, which incorporates extensive data from sources like UniProt and SCOPe.
The USM evaluates the generated protein sequences, predicting their characteristics such as thermostability and solubility, and filters them based on user requirements. Notably, the USM model, with 100 million parameters, demonstrates superior computational efficiency and accuracy compared to existing models, achieving significant performance benchmarks in predicting protein properties. The framework also integrates Reinforcement Learning from Wet-lab Feedback (RLWF) to iteratively optimize the PGA and PGM based on experimental outcomes, addressing challenges like length bias in sequence generation through the innovative R-DPO loss function. This systematic approach enhances the quality and functionality of generated proteins, facilitating efficient protein engineering across various experimental objectives.
Discussion
The discussion section of the research paper presents the capabilities and effectiveness of the ORI framework in engineering proteins with enzyme-like activities, thermostability, and multifunctionality. The study demonstrates that ORI can generate a diverse array of candidate protein sequences, achieving a median sequence identity of 0.96 with known enzymes, while also revealing a weak correlation between sequence and structural identities. This indicates that both metrics are necessary for evaluating engineered proteins. The ORI pipeline significantly enhances the proportion of candidates with desired functional domains from 45.89% to 98.91% after quality control, showcasing the utility of the unified sequence model (USM) in functional feature prediction.
Furthermore, the experimental validation of 100 lysozyme candidates showed comparable expression success rates to natural enzymes, with some variants, such as TX-L6, exhibiting superior activity. The framework also successfully designed thermostable chitinase-like proteins, with several retaining full activity at elevated temperatures, thus extending their operational range. Additionally, ORI facilitated the design of multifunctional enzymes, with the top candidate, TX-ME, outperforming both monofunctional enzymes and natural dual-function counterparts. Overall, the results underscore ORI’s potential as a versatile platform for protein engineering, capable of addressing complex functional requirements without relying on predefined structural templates.