DOI: https://doi.org/10.1186/s12896-026-01109-1
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41680732
تاريخ النشر: 2026-02-12
المؤلف: Li-Zhen Luo وآخرون
الموضوع الرئيسي: تنقية البروتين والاستقرار
نظرة عامة
تقدم البحث نظام علامات اندماج جديدة مصمم لتعزيز التعبير القابل للذوبان للبروتينات المؤتلفة في *Escherichia coli*. يتضمن هذا النظام ثمانية علامات اندماج متوسطة الحجم قابلة للقطع بواسطة TEV (ArsC، Crr، DsbA، Ecotin، MsyB، SlyD، Snut، وYjgD) مدمجة في متجه موحد pET-28b(+). قامت الدراسة بتقييم منهجي لتأثير هذه العلامات على الذوبانية والوظائف لمجموعة متنوعة من البروتينات النموذجية، بما في ذلك البروتين الفلوري الأخضر المعزز (eGFP)، EcFabG، وMals، بالإضافة إلى ستة بروتينات صعبة. أظهرت النتائج أن فعالية كل علامة تعتمد بشكل كبير على البروتين، حيث زادت MsyB وSnut بشكل كبير من الكسر القابل للذوبان لـ eGFP من 15% إلى أكثر من 85%، وعززت SlyD كل من الذوبانية والنشاط لـ Mals.
تؤكد النتائج على الدور الحاسم لاختيار العلامات في تحقيق التعبير القابل للذوبان للبروتينات الصعبة، حيث كانت بعض العلامات ضرورية للتعبير الناجح عن أهداف معينة. يسهل هذا النظام المبتكر الفحص عالي الإنتاجية لشركاء الاندماج، مما يعالج عنق الزجاجة الكبير في إنتاج البروتينات المؤتلفة. من خلال تمكين تحديد الظروف المثلى لتعزيز ذوبانية البروتين ووظيفته، يمثل هذا النظام تقدمًا قيمًا في مجال هندسة البروتين.
مقدمة
تسلط مقدمة هذه الورقة البحثية الضوء على أهمية نظام التعبير في Escherichia coli في التكنولوجيا الحيوية لإنتاج البروتينات المؤتلفة، مع التأكيد على مزاياه مثل الجينات المعروفة جيدًا، والنمو السريع، والعائد العالي، والجدوى الاقتصادية. ومع ذلك، فإن التحديات مثل انحياز الكودون، والانحلال البروتيني، وتجمع البروتينات في أجسام غير قابلة للذوبان تعيق التعبير غير المتجانس للعديد من البروتينات. يتأثر تشكيل هذه التجمعات بعوامل مختلفة، بما في ذلك ظروف الزراعة والخصائص الجوهرية للبروتينات المستهدفة. للتخفيف من هذه القضايا، تم استخدام عدة استراتيجيات، حيث ظهرت استخدام علامات الاندماج كحل بارز لتعزيز الذوبانية، والاستقرار، وتنقية البروتينات المستهدفة.
توضح الورقة نهجًا منهجيًا لتحديد علامات الاندماج المثلى من خلال بناء نظام شامل للتعبير عن البروتينات المؤتلفة في E. coli. يسمح هذا النظام بالت cloning المتوازي للجينات المستهدفة في ثمانية متجهات مختلفة، يحتوي كل منها على علامة اندماج متوسطة الحجم، وصلة مرنة، وموقع قطع إنزيم TEV، وعلامة ارتباط 6×His في الطرف N. تقيم الدراسة تأثيرات هذه العلامات على الذوبانية والوظائف لثلاثة بروتينات نموذجية: البروتين الفلوري الأخضر المعزز (eGFP)، 3-ketoacyl-ACP reductase (EcFabG)، والأميلاز المالطوني (Mals)، بالإضافة إلى ستة بروتينات صعبة التعبير. تؤسس النتائج هذا النظام كمنصة قوية لتعزيز التعبير القابل للذوبان لمجموعة متنوعة من البروتينات المؤتلفة، مما يلبي الحاجة إلى إزالة العلامات بشكل فعال وتحسين إنتاج البروتين في E. coli.
مناقشة
في هذه الدراسة، تم تطوير نظام تعبير علامات اندماج متعدد الاستخدامات لتعزيز التعبير القابل للذوبان لمجموعة متنوعة من البروتينات المؤتلفة في *E. coli*. يعتمد النظام، المستند إلى هيكل pET-28b(+)، على ثمانية علامات اندماج مختلفة (ArsC، Crr، DsbA، Ecotin، MsyB، SlyD، Snut، وYjgD) يمكن ربطها بالبروتينات المستهدفة عبر وصلة صناعية. أظهرت النتائج أن اختيار علامة الاندماج يؤثر بشكل كبير على كل من الذوبانية وسلامة الوظيفة للبروتينات المستهدفة. على سبيل المثال، حسنت علامات مثل MsyB وSnut بشكل ملحوظ من ذوبانية البروتين الفلوري الأخضر المعزز (eGFP) وبروتينات صعبة أخرى، بينما كانت علامات مثل Crr وDsbA أقل فعالية، مما أدى أحيانًا إلى تقليل النشاط الإنزيمي.
تشير النتائج إلى أنه لا توجد علامة اندماج واحدة فعالة عالميًا؛ بل يجب تحديد العلامة المثلى تجريبيًا لكل بروتين مستهدف. كما تبرز الدراسة أهمية مراعاة الخصائص الفيزيائية الحيوية للعلامات، مثل الشحنة والمحبة للماء، والتي ترتبط بقدراتها على تعزيز الذوبانية. ومن الجدير بالذكر أنه بينما حسنت بعض العلامات الذوبانية، إلا أنها قد تتداخل أيضًا مع وظيفة البروتين، مما يبرز الحاجة إلى اختيار دقيق وإمكانية إزالة علامات الاندماج بعد التنقية. بشكل عام، يوفر نظام متجه pX منصة قوية لفحص وتحسين الظروف لتعبير البروتينات المؤتلفة المتنوعة، مما يعالج تحديًا كبيرًا في إنتاج البروتين.
DOI: https://doi.org/10.1186/s12896-026-01109-1
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41680732
Publication Date: 2026-02-12
Author(s): Li-Zhen Luo et al.
Primary Topic: Protein purification and stability
Overview
The research presents a novel fusion tag system designed to enhance the soluble expression of recombinant proteins in *Escherichia coli*. This system incorporates eight medium-sized, TEV-cleavable fusion tags (ArsC, Crr, DsbA, Ecotin, MsyB, SlyD, Snut, and YjgD) integrated into a standardized pET-28b(+) vector. The study systematically assessed the impact of these tags on the solubility and functionality of various model proteins, including enhanced green fluorescent protein (eGFP), EcFabG, and Mals, as well as six challenging proteins. Results indicated that the effectiveness of each tag was highly protein-dependent, with MsyB and Snut significantly increasing the soluble fraction of eGFP from 15% to over 85%, and SlyD enhancing both solubility and activity of Mals.
The findings underscore the critical role of tag selection in achieving soluble expression of difficult proteins, as certain tags were necessary for the successful expression of specific targets. This innovative platform facilitates high-throughput screening of fusion partners, thereby addressing a significant bottleneck in recombinant protein production. By enabling the identification of optimal conditions for enhancing protein solubility and function, this system represents a valuable advancement in the field of protein engineering.
Introduction
The introduction of this research paper highlights the significance of the Escherichia coli expression system in biotechnology for the production of recombinant proteins, emphasizing its advantages such as well-characterized genetics, rapid growth, high yield, and cost-effectiveness. However, challenges such as codon bias, proteolytic degradation, and the aggregation of proteins into insoluble inclusion bodies hinder the heterologous expression of many proteins. The formation of these aggregates is influenced by various factors, including cultivation conditions and the intrinsic properties of the target proteins. To mitigate these issues, several strategies have been employed, with the use of fusion tags emerging as a prominent solution to enhance solubility, stability, and purification of target proteins.
The paper details a systematic approach to identify optimal fusion tags by constructing a comprehensive recombinant protein expression system in E. coli. This system allows for the parallel cloning of target genes into eight different vectors, each containing a medium-sized fusion tag, a flexible linker, a TEV protease cleavage site, and an N-terminal 6×His affinity tag. The study evaluates the effects of these tags on the solubility and functionality of three model proteins: enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP), 3-ketoacyl-ACP reductase (EcFabG), and maltogenic amylase (Mals), as well as six difficult-to-express proteins. The findings establish this system as a robust platform for enhancing the soluble expression of diverse recombinant proteins, addressing the need for efficient tag removal and optimizing protein production in E. coli.
Discussion
In this study, a versatile fusion tag expression system was developed to enhance the soluble expression of various recombinant proteins in *E. coli*. The system, based on the pET-28b(+) backbone, incorporates eight different fusion tags (ArsC, Crr, DsbA, Ecotin, MsyB, SlyD, Snut, and YjgD) that can be attached to target proteins via a synthetic linker. The results demonstrated that the choice of fusion tag significantly influences both the solubility and functional integrity of the target proteins. For instance, tags like MsyB and Snut markedly improved the solubility of enhanced green fluorescent protein (eGFP) and other challenging proteins, while tags such as Crr and DsbA were less effective, sometimes leading to reduced enzymatic activity.
The findings indicate that no single fusion tag is universally effective; rather, the optimal tag must be determined empirically for each target protein. The study also highlights the importance of considering the biophysical properties of the tags, such as charge and hydrophilicity, which correlate with their solubility-enhancing capabilities. Notably, while some tags improved solubility, they could also interfere with protein function, underscoring the need for careful selection and potential removal of fusion tags post-purification. Overall, the pX vector system provides a robust platform for screening and optimizing conditions for the expression of diverse recombinant proteins, addressing a significant challenge in protein production.