DOI: https://doi.org/10.1038/s41557-023-01322-x
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38448507
تاريخ النشر: 2024-03-01
المؤلف: Adam Dorey وآخرون
الموضوع الرئيسي: دراسات نقل المسام النانوية والقنوات النانوية
نظرة عامة
تقدم هذه القسم نظرة عامة على التقدم في تسلسل الأحماض النووية باستخدام تقنية النانوثقب، مع تسليط الضوء على مزاياها مثل سرعة القراءة العالية، الدقة العالية، التكلفة المنخفضة، وقابلية النقل. تتيح هذه الطريقة الخالية من العلامات تسلسل الجزيئات الفردية، مما يمثل إنجازًا كبيرًا في هذا المجال. علاوة على ذلك، يتم مناقشة إمكانيات النانوثقوب لتسلسل البوليببتيدات، مع التأكيد على تداعياتها للاكتشافات البيولوجية، والتشخيصات السريرية، وأمن الوطن، خاصةً حيث أن الطرق الحالية غالبًا ما تكون محدودة في السرعة وقابلية النقل.
تقوم المراجعة بفحص الابتكارات الكيميائية الحيوية التي تدعم تقنيات تسلسل الحمض النووي والحمض النووي الريبي باستخدام النانوثقب في كل من القطاع التجاري والأكاديمي. كما تأخذ في الاعتبار كيف يمكن أن تمهد هذه التقدمات التكنولوجية الطريق لتطورات مستقبلية في تسلسل البروتينات باستخدام النانوثقب، مما يقترح اتجاهًا واعدًا لمزيد من البحث والتطبيق في مجالات متنوعة.
مقدمة
تسلط مقدمة ورقة البحث الضوء على أهمية تسلسل الأحماض النووية عبر مجالات متنوعة، بما في ذلك الجينوميات، الميتاجينوميات، البروتيوميات، التشخيصات السريرية، التحليل الجنائي، وسلامة الغذاء. لتعزيز الوصول، ومعدل الإنتاج، وفعالية التكلفة، ظهرت تقنيات تسلسل الجيل التالي، مع كون تسلسل النانوثقب بارزًا بشكل خاص لقابليته للنقل، وطول قراءاته، وسرعة أوقات القراءة، وقدراته العالية في الإنتاج. تعمل هذه الطريقة، التي تم التعرف عليها كـ “طريقة العام” من قبل *Nature Methods*، عن طريق تمرير الحمض النووي أحادي السلسلة (ssDNA) عبر ثقب بروتيني، حيث يتم قياس الاضطرابات الكهربائية للتيار الأيوني لفك شفرة التسلسل.
على الرغم من التقدم في تسلسل الحمض النووي، فإن الانتقال إلى تسلسل البروتينات باستخدام النانوثقب يقدم تحديات بسبب تعقيد البروتينات، التي تشمل مجموعة واسعة من الأحماض الأمينية والتعديلات ما بعد الترجمة مقارنةً بأربعة قواعد نووية في الحمض النووي. بالإضافة إلى ذلك، فإن الطي المعقد للبروتينات يعقد مرورها عبر النانوثقوب، وغياب طرق التضخيم المماثلة لـ PCR للبروتينات يزيد من تعقيد جهود التسلسل. تهدف الورقة إلى توضيح الأسس الجزيئية لتسلسل الحمض النووي باستخدام النانوثقب التجاري، مع التركيز بشكل خاص على جهاز MinION من Oxford Nanopore Technologies، واستكشاف كيف يمكن أن تُفيد هذه الرؤى في التقدم في تسلسل البروتينات باستخدام النانوثقب. ستقوم المراجعة بمقارنة منهجية بين أجهزة تسلسل الأحماض النووية الحالية ومناقشة الحالة الحالية لتسلسل الببتيدات المعتمد على النانوثقب، مع رسم أوجه التشابه وتحديد التحسينات المحتملة المستوحاة من منهجيات تسلسل الحمض النووي.
مناقشة
تسلط قسم المناقشة في ورقة البحث الضوء على التقدم والآليات المتعلقة بتسلسل الحمض النووي المعتمد على النانوثقب، مع التركيز على أدوار النانوثقوب البروتينية وبروتينات المحرك. تعتبر النانوثقوب البروتينية، وخاصة تلك المشتقة من السموم البكتيرية مثل α-haemolysin وCsgG، جزءًا أساسيًا من عملية التسلسل نظرًا لهياكلها المستقرة وقدرتها على تسهيل مرور الحمض النووي بشكل منظم. يتميز ثقب CsgG، المستخدم في الأجهزة التجارية، بوجود تضييق يسمح بحدوث حجب للتيار الأيوني يتوافق مع تسلسلات النيوكليوتيدات، مع تحسين جهود الهندسة الحديثة لدقة التسلسل إلى 99.3% من خلال تطوير ثقوب مزدوجة التضييق. تعتبر بروتينات المحرك، وبشكل خاص الهيليكازات، ضرورية لتنظيم سرعة الانتقال للحمض النووي أحادي السلسلة (ssDNA) عبر النانوثقب، مما يعزز دقة القراءة من خلال منع المرور السريع الذي قد يؤدي إلى أخطاء.
تناقش هذه القسم أيضًا أهمية الجهد الكهربائي في دفع انتقال الحمض النووي واستخدام محولات البوليمر النووي لتعزيز كفاءة التسلسل. تركز هذه المحولات الحمض النووي عند واجهة الغشاء وتحمل بروتينات المحرك مسبقًا، مما يزيد بشكل كبير من احتمال النجاح في تمريرها إلى النانوثقوب. توضح الورقة أيضًا استراتيجيات التسلسل المختلفة، بما في ذلك التسلسل 1D و2D، وتكييف تقنية النانوثقب لتسلسل الحمض النووي الريبي. بالإضافة إلى ذلك، تستعرض تطوير أغشية بوليمر مرنة تحسن من استقرار أجهزة التسلسل، إلى جانب نضوج التكنولوجيا الخاصة بتسلسل النانوثقب من البحث الأكاديمي إلى التطبيقات التجارية. يتم ذكر تقنيات تسلسل النانوثقب البديلة بإيجاز، مع التأكيد على تنوع الأساليب والابتكار المستمر في هذا المجال.
DOI: https://doi.org/10.1038/s41557-023-01322-x
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38448507
Publication Date: 2024-03-01
Author(s): Adam Dorey et al.
Primary Topic: Nanopore and Nanochannel Transport Studies
Overview
The section provides an overview of the advancements in nucleic acid sequencing using nanopore technology, highlighting its advantages such as rapid read-out, high accuracy, low cost, and portability. This label-free method allows for sequencing at the single-molecule level, marking a significant achievement in the field. Furthermore, the potential of nanopores for sequencing polypeptides is discussed, emphasizing its implications for biological discovery, clinical diagnostics, and homeland security, particularly as existing methods are often limited in speed and portability.
The Review critically examines the biochemical innovations that support both commercial and academic nanopore DNA and RNA sequencing techniques. It also considers how these technological advancements could pave the way for future developments in protein sequencing using nanopores, suggesting a promising direction for further research and application in various fields.
Introduction
The introduction of the research paper highlights the significance of nucleic acid sequencing across various fields, including genomics, metagenomics, proteomics, clinical diagnostics, forensic analysis, and food safety. To enhance accessibility, throughput, and cost-effectiveness, next-generation sequencing technologies have emerged, with nanopore sequencing being particularly notable for its portability, long read lengths, rapid read times, and high throughput capabilities. This method, recognized as “Method of the Year” by *Nature Methods*, operates by threading single-stranded DNA (ssDNA) through a protein nanopore, where electrical perturbations of ionic current are measured to decode the sequence.
Despite the advancements in DNA sequencing, the transition to protein sequencing using nanopores presents challenges due to the complexity of proteins, which include a wider variety of amino acids and post-translational modifications compared to the four nucleobases in DNA. Additionally, the intricate folding of proteins complicates their passage through nanopores, and the absence of amplification methods analogous to PCR for proteins further complicates sequencing efforts. The paper aims to elucidate the molecular foundations of commercial nanopore DNA sequencing, particularly focusing on the MinION device from Oxford Nanopore Technologies, and to explore how these insights can inform advancements in nanopore protein sequencing. The review will systematically compare existing nucleic acid sequencers and discuss the current state of nanopore-based peptide sequencing, drawing parallels and identifying potential improvements inspired by DNA sequencing methodologies.
Discussion
The discussion section of the research paper highlights the advancements and mechanisms of nanopore-based DNA sequencing, focusing on the roles of protein nanopores and motor proteins. Protein nanopores, particularly those derived from bacterial cytotoxins like α-haemolysin and CsgG, are integral to the sequencing process due to their stable structures and ability to facilitate the controlled passage of DNA. The CsgG pore, utilized in commercial devices, features a constriction that allows for ionic current blockades corresponding to nucleotide sequences, with recent engineering efforts improving sequencing accuracy to 99.3% through the development of dual-constriction pores. Motor proteins, specifically helicases, are crucial for regulating the translocation speed of single-stranded DNA (ssDNA) through the nanopore, enhancing read accuracy by preventing rapid passage that could lead to errors.
The section also discusses the importance of electrical potential in driving DNA translocation and the use of polynucleotide adapters to enhance sequencing efficiency. These adapters concentrate DNA at the membrane interface and preload motor proteins, significantly increasing the likelihood of successful threading into nanopores. The paper further outlines various sequencing strategies, including 1D and 2D sequencing, and the adaptation of nanopore technology for RNA sequencing. Additionally, it reviews the development of resilient polymer membranes that improve the stability of sequencing devices, alongside the technological maturation of nanopore sequencing from academic research to commercial applications. Alternative nanopore sequencing techniques are briefly mentioned, emphasizing the diversity of approaches and the ongoing innovation in the field.