DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-025-57992-3
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40113759
تاريخ النشر: 2025-03-20
المؤلف: Ziyi Wang وآخرون
الموضوع الرئيسي: علم النسخ الجيني أحادي الخلية والمكاني
نظرة عامة
تسلط الأبحاث الضوء على الفهم الناشئ للتنوع في التغيرات الظاهرية والنسخية على مستوى الخلية الواحدة استجابةً للإجهاد التأكسدي والشيخوخة. على الرغم من الأهمية المعترف بها لعملية الأيض الخلوي، إلا أن هناك نقصًا في الاستكشاف الشامل لتنوع الميتابولوم وعلاقته بالحالات التأكسدية والشيخوخة. يقدم المؤلفون تقنية جديدة، وهي التصوير الحي للخلية الواحدة مع مطياف الكتلة (SCLIMS)، والتي تتيح التقييم المتزامن للملفات الميتابولومية ومستويات الأكسدة في الخلايا الفردية. تكشف هذه الطريقة عن تباين ميتابولومي كبير بين الخلايا التي تظهر حالات أكسدة مختلفة، حيث يؤثر المشهد الميتابولومي الموجود مسبقًا على استجابات الخلايا للإجهاد التأكسدي.
من الجدير بالذكر أن الدراسة تظهر أن الإضافة إلى بعض الميتابوليتات المحددة التي تم تحديدها من خلال SCLIMS يمكن أن تخفض مستويات الأكسدة وتطيل عمر *C. elegans*. وهذا يبرز إمكانيات SCLIMS كأداة قوية للميتابولوميات التكاملية والتوصيف الظاهري على مستوى الخلية الواحدة، مما يمهد الطريق لتحقيقات أعمق في التنوع الأيضي عبر سياقات بيولوجية مختلفة. تسهم النتائج في النقاش الأوسع حول تحليل الخلية الواحدة، الذي حظي باهتمام متزايد لفهم تعقيدات الوراثة، والبروتيوميات، والميتابولوميات في عمليات مثل التطور، والسرطان، والشيخوخة.
مقدمة
في هذه الدراسة، استخدم الباحثون سلالة Caenorhabditis elegans (C. elegans) N2 البرية، التي تم زراعتها على وسط نمو الديدان (NGM) معززة بـ E. coli OP50 عند درجة حرارة 20 °م. شمل الحفاظ على صفائح الديدان نقل الديدان كل ثلاثة أيام لضمان ظروف نمو مثالية.
للتجارب، تم اختيار مراحل تطورية مختلفة من الديدان: تم إجراء صبغة DHE وتحليل الاهتزاز على الديدان في مرحلة L4 ومرة أخرى في اليوم التاسع بعد L4، بينما راقب تحليل العمر بقاء الديدان طوال فترة حياتها. بالإضافة إلى ذلك، تم إجراء تحليل النشاط على الديدان في اليوم الأول، اليوم الخامس، واليوم التاسع بعد الوصول إلى مرحلة L4، مما يسمح بتقييم شامل للتغيرات المرتبطة بالعمر في السلوك والفسيولوجيا.
طرق
تدمج منصة SCLIMS التصوير الحي للخلية وتحليل الكتلة الخلوية الفردية (MS) لتقييم الإجهاد التأكسدي وتحليل المكونات السيتوبلازمية على مستوى الخلية الواحدة. في البداية، تم صبغ الخلايا بمحلول DCFDA بتركيز 10 ميكرومولار لمدة 25 دقيقة عند 37 °م و5% CO₂، تلاها غسل باستخدام PBS. تم استخدام المجهر الفلوري لالتقاط صور الخلايا، مما يسمح بتحديد مستويات الإجهاد التأكسدي. بعد ذلك، تم نقل الخلايا المختارة إلى إعداد قفل الخلية الواحدة، حيث تم حضنها في محلول حمام يحتوي على 140 مليمولار NaCl، 5 مليمولار KCl، 2 مليمولار CaCl₂، 1 مليمولار MgCl₂، و10 مليمولار HEPES (pH 7.4). تم استخدام أنبوب زجاجي بوروسيليكاتي مملوء بمحلول 88 مليمولار NH₄HCO₃ لربط الخلايا، مما يحقق ختمًا عالي الجودة (>1 GΩ) قبل استخراج المحتويات السيتوبلازمية لتحليل MS.
بالنسبة لمطياف الكتلة، تم تطبيق جهد متناوب قدره 4 كيلو فولت عند حوالي 500 هرتز على أنبوب الرش، مع الحفاظ على مسافة 5 مم من فتحة MS. تم إجراء قياسات الكتلة عالية الدقة باستخدام جهاز Q Exactive Plus MS، مع معلمات محددة تشمل درجة حرارة الكابيلاري 275 °م، مستوى RF عند 50%، ودقة الكتلة 70,000. تم إجراء جمع البيانات في وضع الأيونات السلبية تحت ظروف المسح الكامل، مع ضبط طاقة تصادم MS/MS على hcd = 30. تم معالجة بيانات MS الناتجة وربطها بمستويات الإجهاد التأكسدي المستمدة من التصوير الفلوري، مما يربط الحالات الكيميائية الحيوية الخلوية بمقاييس الإجهاد التأكسدي.
النتائج
يقدم قسم “النتائج” من ورقة البحث النتائج الرئيسية المستمدة من التجارب والتحليلات التي تم إجراؤها. تشير البيانات إلى وجود ارتباط كبير بين المتغير المستقل والنتائج التابعة، حيث أسفرت الاختبارات الإحصائية عن قيم p أقل من 0.05، مما يشير إلى وجود دليل قوي ضد الفرضية الصفرية. بالإضافة إلى ذلك، تظهر النتائج اتجاهًا واضحًا في الظواهر الملاحظة، والتي تتماشى مع التوقعات النظرية الموضحة في المقدمة.
علاوة على ذلك، توضح التمثيلات البيانية، مثل الرسوم البيانية المتناثرة والمخططات التكرارية، توزيع العلاقات بين المتغيرات. من الجدير بالذكر أن التحليل يكشف أن حجم التأثير كبير، مما يشير إلى أهمية عملية عملية بالإضافة إلى الأهمية الإحصائية. تسهم هذه النتائج في المعرفة الحالية وتوفر أساسًا لتوجهات البحث المستقبلية.
مناقشة
في هذا القسم، تناقش الأبحاث دمج التصوير الحي للخلية الواحدة ومطياف الكتلة (SCLIMS) للتحقيق في العلاقة بين الإجهاد التأكسدي الخلوي (OS) والأيض على مستوى الخلية الواحدة. باستخدام خلايا HEK293T المعرضة للإجهاد التأكسدي عبر معالجة بيروكسيد الهيدروجين، استخدمت الدراسة ثنائي كلوريد ثنائي هيدروفلوريسين داي أستات (DCFDA) للتصوير الحي للخلية لتقييم مستويات OS. كشف التحليل عن أكثر من 500 إشارة أيونية، مع 162 ميتابوليت تم توثيقها من قاعدة بيانات الميتابولوم البشري (HMDB). من الجدير بالذكر أن 83 ميتابوليت تم تأكيدها من خلال MS/MS، وتم ربط وفرتها بشدة DCFDA، مما يشير إلى تأثير كبير لـ OS على الأيض الخلوي. أظهرت النتائج أن معظم الميتابوليتات كانت مرتبطة عكسيًا بمستويات OS، مما يشير إلى أن تقليل الميتابوليتات، بما في ذلك ATP والجلوتاثيون (GSH)، هو سمة مميزة للإجهاد التأكسدي.
علاوة على ذلك، حددت تقنية SCLIMS ستة أنواع فرعية ميتابولومية متميزة بين الخلايا، كل منها يظهر مستويات مختلفة من OS. أشار تحليل الزمن الزائف إلى تقدم من الإجهاد التأكسدي المنخفض إلى العالي، مع علامات ميتابولومية محددة تميز كل نوع فرعي. تم تطوير نماذج التعلم الآلي للتنبؤ بمستويات OS الخلوية بناءً على الملفات الميتابولومية، محققة دقة عالية ومعاملات ارتباط. استكشفت الدراسة أيضًا التنوع الأيضي الأساسي للخلايا غير المعالجة، كاشفة أنه بينما كانت مستويات OS متجانسة، كانت الملفات الميتابولومية تختلف بشكل كبير. وهذا يشير إلى أن الحالة الأيضية الأولية قد تؤثر على الاستجابة اللاحقة للإجهاد التأكسدي، مما يثبت وجود علاقة سببية بين التنوع الأيضي وحالة OS. بشكل عام، توضح منصة SCLIMS التفاعل بين الأيض الخلوي والإجهاد التأكسدي، مما يوفر رؤى حول التغيرات الأيضية المرتبطة بالإجهاد التأكسدي عبر أنواع خلايا مختلفة.
DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-025-57992-3
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40113759
Publication Date: 2025-03-20
Author(s): Ziyi Wang et al.
Primary Topic: Single-cell and spatial transcriptomics
Overview
The research highlights the emerging understanding of heterogeneity in phenotypic and transcriptional changes at the single-cell level in response to oxidative stress and senescence. Despite the recognized importance of cellular metabolism, a thorough exploration of metabolomic diversity and its relationship with oxidative and senescent states has been lacking. The authors introduce a novel technique, single-cell live imaging with mass spectrometry (SCLIMS), which enables the simultaneous assessment of metabolomic profiles and oxidative levels in individual cells. This approach reveals significant metabolomic variability among cells exhibiting different oxidative statuses, with the pre-existing metabolomic landscape influencing cellular responses to oxidative stress.
Notably, the study demonstrates that supplementation with specific metabolites identified through SCLIMS can lower oxidative levels and extend the lifespan of *C. elegans*. This underscores the potential of SCLIMS as a powerful tool for integrative metabolomics and phenotypic characterization at the single-cell level, paving the way for deeper investigations into metabolic heterogeneity across various biological contexts. The findings contribute to the broader discourse on single-cell analysis, which has garnered increasing interest in understanding the complexities of genetics, proteomics, and metabolomics in processes such as development, cancer, and aging.
Introduction
In this study, the researchers utilized the Caenorhabditis elegans (C. elegans) N2 wild isolate strain, which was cultured on Nematode Growth Medium (NGM) supplemented with E. coli OP50 at a temperature of 20 °C. The maintenance of the worm plates involved transferring the worms every three days to ensure optimal growth conditions.
For the experiments, different developmental stages of the worms were selected: DHE staining and thrashing analysis were conducted on worms at the L4 stage and again at Day 9 post-L4, while lifespan analysis monitored the survival of worms throughout their entire lifespan. Additionally, activity analysis was performed on worms at Day 1, Day 5, and Day 9 after reaching the L4 stage, allowing for a comprehensive assessment of age-related changes in behavior and physiology.
Methods
The SCLIMS platform integrates live-cell imaging and single-cell mass spectrometry (MS) to assess oxidative stress and analyze cytoplasmic constituents at the single-cell level. Initially, cells were stained with a 10 μM DCFDA solution for 25 minutes at 37 °C and 5% CO₂, followed by PBS washing. Fluorescent microscopy was employed to capture images of the cells, allowing for the quantification of oxidative stress levels. Subsequently, selected cells were transferred to a single-cell patch clamp setup, where they were incubated in a bath solution containing 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, and 10 mM HEPES (pH 7.4). A borosilicate glass pipette filled with an 88 mM NH₄HCO₃ solution was used to patch the cells, achieving a high-quality seal (>1 GΩ) before extracting cytoplasmic contents for MS analysis.
For mass spectrometry, an AC voltage of 4 kV at approximately 500 Hz was applied to the spray capillary micropipette, maintaining a 5 mm distance from the MS orifice. High-resolution mass measurements were conducted using a Q Exactive Plus MS instrument, with specific parameters including a capillary temperature of 275 °C, RF level at 50%, and mass resolution of 70,000. Data acquisition was performed in negative ion mode under full scan conditions, with MS/MS collision energy set to hcd = 30. The resulting MS data were processed and correlated with oxidative stress levels derived from the fluorescent imaging, thereby linking cellular biochemical states to oxidative stress metrics.
Results
The “Results” section of the research paper presents key findings derived from the conducted experiments and analyses. The data indicates a significant correlation between the independent variable and the dependent outcomes, with statistical tests yielding p-values less than 0.05, suggesting strong evidence against the null hypothesis. Additionally, the results demonstrate a clear trend in the observed phenomena, which aligns with the theoretical predictions outlined in the introduction.
Furthermore, graphical representations, such as scatter plots and histograms, illustrate the distribution and relationships among the variables. Notably, the analysis reveals that the effect size is substantial, indicating practical significance in addition to statistical significance. These findings contribute to the existing body of knowledge and provide a foundation for future research directions.
Discussion
In this section, the research discusses the integration of single-cell live imaging and mass spectrometry (SCLIMS) to investigate the relationship between cellular oxidative stress (OS) and metabolism at the single-cell level. Using HEK293T cells subjected to oxidative stress via hydrogen peroxide treatment, the study employed dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFDA) for live-cell imaging to assess OS levels. The analysis revealed over 500 ion signals, with 162 metabolites annotated from the Human Metabolome Database (HMDB). Notably, 83 metabolites were confirmed through MS/MS, and their abundance was correlated with DCFDA intensity, indicating a significant impact of OS on cellular metabolism. The findings demonstrated that the majority of metabolites inversely correlated with OS levels, suggesting that downregulation of metabolites, including ATP and glutathione (GSH), is a hallmark of oxidative stress.
Furthermore, the SCLIMS technique identified six distinct metabolic subtypes among the cells, each exhibiting varying levels of OS. A pseudotime analysis indicated a progression from low to high oxidative stress, with specific metabolic markers characterizing each subtype. Machine learning models were developed to predict cellular OS levels based on metabolic profiles, achieving high accuracy and correlation coefficients. The study also explored the baseline metabolic heterogeneity of untreated cells, revealing that while OS levels were uniform, metabolic profiles varied significantly. This suggests that the initial metabolic state may influence the subsequent response to oxidative stress, establishing a causal relationship between metabolic heterogeneity and OS status. Overall, the SCLIMS platform effectively elucidates the interplay between cellular metabolism and oxidative stress, providing insights into the metabolic alterations associated with oxidative stress across different cell types.