DOI: https://doi.org/10.1016/j.cels.2025.101169
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39919749
تاريخ النشر: 2025-02-01
المؤلف: Guillermo Nevot وآخرون
الموضوع الرئيسي: فيتامين C وأبحاث مضادات الأكسدة
نظرة عامة
تناقش هذه القسم البحث والتطبيقات لتداخل CRISPR (CRISPRi) كأداة للنمذجة السريعة للعيوب الغذائية، وهي تعديلات جينية تجعل الكائنات غير قادرة على تصنيع مركبات معينة ضرورية للنمو. هذه الطريقة ذات صلة خاصة لاستراتيجيات الاحتواء البيولوجي، حيث يتم تصميم الكائنات المهندسة لتكون محدودة ذاتياً في بيئاتها.
بالإضافة إلى ذلك، يبرز القسم التكيف والاكتشاف من جديد للعناصر التنظيمية التي تمكّن من قدرات الاستشعار الديناميكية في *Cutibacterium acnes*. تشير هذه التطورات إلى تطبيقات محتملة في علم الأحياء الاصطناعي، حيث يمكن أن يعزز التحكم الدقيق في التعبير الجيني من وظيفة الأنظمة الميكروبية المهندسة. بشكل عام، تؤكد النتائج على تعددية استخدام CRISPRi في كل من الاحتواء البيولوجي وتطوير الأنظمة البيولوجية الاستجابة.
مقدمة
تسلط المقدمة الضوء على الدور المتعدد الأوجه للجلد كأكبر عضو في جسم الإنسان، حيث يعمل ليس فقط كحاجز واقي ولكن أيضاً كلاعب رئيسي في الوظائف الفسيولوجية مثل تنظيم الحرارة والمراقبة المناعية. مع وجود أكثر من 3,000 حالة جلدية تؤثر على ما يقرب من ثلث سكان العالم، يمكن أن تؤثر هذه الأمراض بشكل كبير على جودة الحياة، بدءًا من حالات تهدد الحياة مثل الميلانوما الخبيثة إلى مشاكل مزمنة مثل الصدفية والتهاب الجلد التأتبي (AD). تركز العلاجات الحالية بشكل أساسي على إدارة الأعراض وغالبًا ما تأتي مع آثار جانبية سلبية، بينما تقدم العلاجات الجديدة التي تستهدف الآليات المناعية، مثل دوبيلوماب لالتهاب الجلد التأتبي، تحديات اقتصادية كبيرة بسبب تكاليفها العالية.
يناقش القسم أيضًا المنتجات البيولوجية العلاجية الحية المهندسة (eLBPs) كمسار واعد لعلاج الجلد، مستفيدًا من التكيف الطبيعي للميكروبات البشرية مع التعزيزات الاصطناعية. بينما أظهرت بعض eLBPs نجاحًا في علاج أمراض مختلفة، لا يزال تطبيقها في علم الأمراض الجلدية محدودًا. من الجدير بالذكر أن بكتيريا حمض اللاكتيك وStaphylococcus epidermidis قد تم استكشافها لإمكاناتها في شفاء الجروح والتطعيم ضد السرطان، لكن فعاليتها كـ eLBPs مقيمة في الجلد على المدى الطويل مشكوك فيها. بالمقابل، يمثل *Cutibacterium acnes*، وهو الأكثر وفرة بين الكائنات المتعايشة في الجلد، مرشحًا أكثر استقرارًا وملاءمة لنشر eLBP بسبب انخفاض معدل دورانه واستقراره الجينومي، على الرغم من ارتباطه التاريخي بحب الشباب. تضع المقدمة الأساس لاستكشاف المزيد حول C. acnes وأنماطه الفيلوجينية المحددة فيما يتعلق بصحة الجلد والمرض.
الطرق
في هذا القسم، يوضح المؤلفون المواد والطرق المستخدمة في دراستهم، مع التركيز على البلازميدات والسلالات الميكروبية والإجراءات التجريبية. تم توثيق البلازميدات ذات الصلة بالبحث في الجدول S3، مع توفر التسلسلات في البيانات S1. ستكون هذه البلازميدات متاحة من خلال Addgene ومجموعة الأخوة للمعمارية الأوروبية القياسية (SEVA). تشمل الطرق مجموعة متنوعة من التقنيات، بما في ذلك إعداد وتحويل خلايا *C. acnes* القابلة للكهرباء، والكشف المناعي عن سوبر أكسيد ديسموتاز (SOD) المفرز، واستخراج RNA، وRT-PCR الكمي، من بين أمور أخرى. يتم توفير منهجيات مفصلة في النسخة الإلكترونية من الورقة.
تم الحصول على السلالات الميكروبية المستخدمة، وخاصة *C. acnes* KPA171202، من مجموعة الميكروبات الألمانية وزرعت في ظروف لاهوائية. استخدمت الدراسة وسائط نمو محددة، بما في ذلك أجار بروسلا ومغذيات الدماغ والقلب (BHI)، مع تعديل الظروف لاحتياجات تجريبية مختلفة، مثل اختبار العيوب الغذائية عن طريق حذف أحماض أمينية معينة. يصف المؤلفون أيضًا التحليلات الإحصائية وطرق التكميم، بما في ذلك قياس تدفق الخلايا وتسلسل RNA، لضمان تكرار وموثوقية النتائج.
النتائج
في هذه الدراسة، تم تطوير مجموعة أدوات متعددة الاستخدامات لهندسة *Corynebacterium acnes*، مع تحسين بلازميد مشتق من *Propionibacterium freudenreichii*. تضمنت التعديلات الرئيسية إزالة التسلسلات غير الأساسية وتكييف البلازميد للتجميع المعياري عبر التجميع الحراري. تتميز مجموعة الأدوات بوجود أصلين للتكرار وكاسيتات مقاومة للمضادات الحيوية لكل من *E. coli* و*C. acnes*، مما يسهل التبادل السريع للمكونات الجينية. اختبر الباحثون تسعة محفزات تكوينية داخلية ومحفزًا اصطناعيًا، وحددوا الأخير كالأكثر فعالية في دفع التعبير عن البروتينات الفلورية، وخاصة mCherry، الذي تم اختياره لمزيد من التجارب بسبب نطاقه الديناميكي وتوافقه مع الظروف اللاهوائية.
استكشفت الدراسة أيضًا تداخل CRISPR (CRISPRi) لتقليل التعبير الجيني في *C. acnes*، مما أظهر بنجاح قمع الجين اللاكز الداخلي. علاوة على ذلك، سعى الباحثون لإنشاء سلالات عيب غذائي للاحتواء البيولوجي من خلال استهداف الجينات المشاركة في تخليق الأحماض الأمينية. تم إنتاج سلالات ناقصة في تخليق الليسين، والبروتين، والهستيدين، مؤكدة طبيعتها العيب الغذائي من خلال اختبارات النمو. بالإضافة إلى ذلك، أظهرت السلالات المهندسة أنها تنتج وتفرز سوبر أكسيد ديسموتاز (SodC-F1)، مما يقلل بشكل فعال من مستويات أنواع الأكسجين التفاعلية في الكيراتينوسيتات المعرضة لضوء UVB. بشكل عام، تؤسس هذه الأبحاث *C. acnes* كهيكل واعد للعلاجات البيولوجية الحية المهندسة (eLBPs) مع تطبيقات محتملة في علاجات ميكروبيوم الجلد، مما يوفر مجموعة أدوات أساسية للدراسات المستقبلية في هذا المجال.
المناقشة
في هذا القسم، يناقش المؤلفون إمكانيات *Cutibacterium acnes* (C. acnes) كهيكل لتطوير علاجات جلدية قائمة على الميكروبيوم. يبرزون انخفاضًا ملحوظًا في نسبة C. acnes في الجلد ويظهرون أن C. acnes يمكن زراعته بفعالية من جلد المتبرع إلى جلد المستلم، مما يعدل وفرة السلالة في المستلم لعدة أسابيع. تقدم الدراسة مجموعة أدوات تمكينية للتلاعب بـ C. acnes، بما في ذلك اكتشاف العيوب الغذائية وإنشاء سلالات خالية من علامات المضادات الحيوية، وهي ضرورية للنشر الآمن في التطبيقات الجلدية. بالإضافة إلى ذلك، يصمم المؤلفون أنظمة طبيعية واصطناعية قابلة للتحفيز لتفعيل التعبير الجيني ويقدمون إثبات مفهوم من خلال هندسة سلالة تنتج مضادات الأكسدة قادرة على حماية الكيراتينوسيتات من الإجهاد التأكسدي الناتج عن الأشعة فوق البنفسجية.
كما يعترف المؤلفون بمساهمات أفراد ومؤسسات مختلفة، فضلاً عن مصادر التمويل التي دعمت أبحاثهم. يؤكدون على الطبيعة التعاونية للمشروع، موضحين أدوار أعضاء الفريق المختلفين في تصميم التجارب، وإجراء التحليلات، وصياغة المخطوطة. يختتم القسم بإعلان عن المصالح، مشيرين إلى أن بعض المؤلفين قد قدموا براءات اختراع تتعلق بالتقنيات الموصوفة في الدراسة. بشكل عام، تؤكد النتائج على تعددية استخدام C. acnes في هندسة ميكروبيوم الجلد وإمكاناتها العلاجية.
DOI: https://doi.org/10.1016/j.cels.2025.101169
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39919749
Publication Date: 2025-02-01
Author(s): Guillermo Nevot et al.
Primary Topic: Vitamin C and Antioxidants Research
Overview
This section discusses the research and applications of CRISPR interference (CRISPRi) as a tool for the rapid prototyping of auxotrophies, which are genetic modifications that render organisms unable to synthesize certain compounds necessary for growth. This approach is particularly relevant for biocontainment strategies, where engineered organisms are designed to be self-limiting in their environments.
Additionally, the section highlights the adaptation and de novo discovery of regulatory elements that enable dynamic sensing capabilities in *Cutibacterium acnes*. This advancement suggests potential applications in synthetic biology, where precise control over gene expression can enhance the functionality of engineered microbial systems. Overall, the findings underscore the versatility of CRISPRi in both biocontainment and the development of responsive biological systems.
Introduction
The introduction highlights the multifaceted role of the skin as the largest organ in the human body, serving not only as a protective barrier but also as a key player in physiological functions like heat regulation and immune surveillance. With over 3,000 skin conditions affecting nearly one-third of the global population, these diseases can significantly impair quality of life, ranging from life-threatening conditions like malignant melanoma to chronic issues such as psoriasis and atopic dermatitis (AD). Current treatments primarily focus on symptom management and often come with adverse effects, while novel therapies targeting immune mechanisms, such as dupilumab for AD, present substantial economic challenges due to their high costs.
The section also discusses engineered live biotherapeutic products (eLBPs) as a promising avenue for skin treatment, leveraging the natural adaptation of human microbes combined with synthetic enhancements. While some eLBPs have shown success in treating various diseases, their application in dermatology remains limited. Notably, lactic acid bacteria and Staphylococcus epidermidis have been explored for their potential in wound healing and cancer vaccination, but their effectiveness as long-term skin-resident eLBPs is questionable. In contrast, Cutibacterium acnes, the most abundant skin commensal, presents a more stable and suitable candidate for eLBP deployment due to its low turnover and genomic stability, despite its historical association with acne vulgaris. The introduction sets the stage for further exploration of C. acnes and its specific phylotypes in relation to skin health and disease.
Methods
In this section, the authors detail the materials and methods utilized in their study, focusing on the plasmids, microbial strains, and experimental procedures. Plasmids relevant to the research are cataloged in Table S3, with sequences available in Data S1. These plasmids will be accessible through Addgene and the Standard European Vector Architecture (SEVA) sibling collection. The methods encompass a variety of techniques, including the preparation and transformation of electrocompetent *C. acnes* cells, immunodetection of secreted superoxide dismutase (SOD), RNA extraction, and quantitative RT-PCR, among others. Detailed methodologies are provided in the online version of the paper.
The microbial strains used, particularly *C. acnes* KPA171202, were sourced from the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures and cultured under anaerobic conditions. The study employed specific growth media, including Brucella agar and brain-heart infusion (BHI), with conditions adjusted for various experimental needs, such as testing auxotrophies by omitting specific amino acids. The authors also describe the statistical analyses and quantification methods, including flow cytometry and RNA sequencing, to ensure reproducibility and reliability of the findings.
Results
In this study, a versatile toolbox for engineering *Corynebacterium acnes* was developed, optimizing a plasmid derived from *Propionibacterium freudenreichii*. Key modifications included the removal of non-essential sequences and the adaptation of the plasmid for modular cloning via isothermal assembly. The toolbox features two origins of replication and antibiotic resistance cassettes for both *E. coli* and *C. acnes*, facilitating the rapid exchange of genetic components. The researchers tested nine endogenous constitutive promoters and a synthetic promoter, identifying the latter as the most effective for driving expression of fluorescent proteins, particularly mCherry, which was selected for further experiments due to its dynamic range and compatibility with anaerobic conditions.
The study also explored CRISPR interference (CRISPRi) for gene knockdown in *C. acnes*, successfully demonstrating the repression of the endogenous lacZ gene. Furthermore, the researchers aimed to create auxotrophic strains for biocontainment by targeting genes involved in amino acid biosynthesis. They generated strains deficient in lysine, proline, and histidine biosynthesis, confirming their auxotrophic nature through growth assays. Additionally, the engineered strains were shown to produce and secrete superoxide dismutase (SodC-F1), effectively reducing reactive oxygen species levels in keratinocytes exposed to UVB light. Overall, this research establishes *C. acnes* as a promising chassis for engineered living biotherapeutics (eLBPs) with potential applications in skin microbiome therapies, providing a foundational toolkit for future studies in this area.
Discussion
In this section, the authors discuss the potential of *Cutibacterium acnes* (C. acnes) as a chassis for developing microbiome-based skin therapies. They highlight a characteristic decrease in the proportion of C. acnes in the skin and demonstrate that C. acnes can be effectively transplanted from donor to recipient skin, modulating the recipient’s strain abundance for several weeks. The study presents an enabling toolbox for manipulating C. acnes, including the discovery of auxotrophies and the creation of antibiotic-marker-free strains, which are essential for safe deployment in skin applications. Additionally, the authors design natural and synthetic inducible systems for gene expression activation and provide a proof of concept by engineering an antioxidant-producing strain capable of protecting keratinocytes from UV-induced oxidative stress.
The authors also acknowledge the contributions of various individuals and institutions, as well as the funding sources that supported their research. They emphasize the collaborative nature of the project, detailing the roles of different team members in designing experiments, performing analyses, and drafting the manuscript. The section concludes with a declaration of interests, indicating that some authors have filed patents related to the technologies described in the study. Overall, the findings underscore the versatility of C. acnes in skin microbiome engineering and its potential therapeutic applications.