DOI: https://doi.org/10.1038/s41541-025-01124-x
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40246950
تاريخ النشر: 2025-04-17
المؤلف: Amanda E. Zelkoski وآخرون
الموضوع الرئيسي: الاستجابة المناعية والالتهاب
طرق
في هذه الدراسة، تم استخدام خطوط خلايا THP-1-Dual™ و A549-Dual™ لمجموعة متنوعة من التجارب، بما في ذلك تجارب المراسل، والميكروسكوبية، وقياس التدفق الخلوي. خط خلايا THP-1-Dual™، وهو نموذج لخلايا أحادية بشرية، يعبر عن مراسلين: الفوسفاتاز القلوي المفرز (SEAP) الذي يتم تنشيطه بواسطة NF-κB ومراسل اللوكيفيراز المفرز المستجيب لتنشيط مسار IRF. تم أيضًا إنتاج متغيرات knockout لـ MyD88 و TRIF و TLR4 في هذا السياق المزدوج للمراسل. تم زراعة الخلايا في وسط RPMI 1640 معزز بـ L-glutamine و HEPES و مصل جنين البقر (FBS) و Pen-Strep، وتم الحفاظ عليها تحت ظروف قياسية (37 درجة مئوية، 5% CO₂)، مع إعطاء المضادات الحيوية الانتقائية كل أسبوعين.
تم زراعة خط خلايا A549-Dual™، الذي يمثل خلايا الظهارة التنفسية البشرية، بطريقة مماثلة في DMEM معزز بـ L-glutamine و FBS و Pen-Strep تحت نفس الظروف البيئية. تؤسس هذه الإطار المنهجي منصة قوية للتحقيق في مسارات الإشارة التي تتوسطها NF-κB و IRF استجابة لمجموعة متنوعة من المحفزات في كل من سياقات الخلايا الأحادية والظهارية.
النتائج
تدرس الدراسة تنشيط مسارات NF-κB و IRF في خلايا THP-1 الشبيهة بالخلايا الأحادية بواسطة جزيئات الدهون القابلة للتأين (LNPs). تشير النتائج إلى أن LNPs القابلة للتأين الفارغة، وبشكل خاص LNP-1 و LNP-ALC315 و LNP-SM102، تنشط NF-κB بشكل كبير، حيث أظهر LNP-1 أعلى تنشيط (زيادة بمقدار 6-7 مرات عند 48 و 72 ساعة). بالمقابل، كانت استجابة IRF أقل وضوحًا، حيث أظهرت LNP-ALC315 و LNP-1 زيادة بمقدار 3 مرات و 1.7 مرة، على التوالي، عند 48 ساعة. من الجدير بالذكر أن غياب مكون الدهون القابلة للتأين في LNPs أدى إلى فقدان كامل لكل من تنشيط NF-κB و IRF، مما يبرز الدور الحاسم لهذا المكون في الوساطة للاستجابات المناعية.
كشفت حركيات التنشيط أنه بينما حفزت المحفزات TLR استجابات سريعة خلال 24 ساعة، بلغ تنشيط LNP ذروته عند 48-72 ساعة. على الرغم من الاستيعاب المستمر لـ LNPs بواسطة خلايا THP-1 مع مرور الوقت، لم تؤثر مثبطات البلعمة بشكل كبير على تنشيط NF-κB أو IRF، مما يشير إلى أنه على الرغم من حدوث الاستيعاب، قد لا يكون ضروريًا لبدء هذه المسارات الإشارية. بشكل عام، تسلط النتائج الضوء على ملفات التنشيط المتميزة لـ LNPs القابلة للتأين في الخلايا الأحادية وأهمية الدهون القابلة للتأين في دفع الاستجابات المناعية.
المناقشة
تسلط قسم المناقشة في ورقة البحث الضوء على تنشيط خطوط خلايا الأحادية بواسطة جزيئات الدهون القابلة للتأين (LNPs)، مع التركيز بشكل خاص على زيادة تنظيم مسارات إشارة مستقبلات Toll-like (TLR). توضح الدراسة أن LNP-1، من بين تركيبات أخرى، ينشط بشكل كبير مسارات NF-κB وعوامل تنظيم الإنترفيرون (IRF)، مما يؤدي إلى إنتاج السيتوكينات. كشفت تحليل شامل للتعبير الجيني عن 10,585 جينًا معبرًا عنه بشكل مختلف (DEGs) في خلايا THP-1 المحفزة بـ LNP-1، مع زيادة ملحوظة في وحدات NF-κB (NFKB2 و RELB) و IRFs (IRF4 و IRF7). تشير النتائج إلى أن TLR4، بشكل أساسي من خلال موصل MyD88، يلعب دورًا حاسمًا في الوساطة لهذه الاستجابات المناعية، على الرغم من أن مسارات أخرى قد تساهم أيضًا.
من المثير للاهتمام، أن الدراسة وجدت أن إضافة mRNA إلى LNPs لم تعزز تنشيط NF-κB أو IRF مقارنةً بـ LNPs الفارغة، مما يشير إلى أن LNP نفسه هو المحرك الرئيسي لتنشيط المناعة الفطرية في سياق لقاحات mRNA مثل BNT162b2. تؤكد الأبحاث على أهمية الخصائص الهيكلية للدهون القابلة للتأين في تعديل الاستجابات المناعية وتقترح أن تحسين هذه التركيبات الدهنية قد يعزز فعالية اللقاح مع تقليل ردود الفعل السلبية. بشكل عام، توفر الدراسة رؤى قيمة حول آليات تنشيط المناعة التي تتوسطها LNP، مما يبرز الإمكانية للتعديلات المستهدفة لتحسين تصميم اللقاحات.
DOI: https://doi.org/10.1038/s41541-025-01124-x
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40246950
Publication Date: 2025-04-17
Author(s): Amanda E. Zelkoski et al.
Primary Topic: Immune Response and Inflammation
Methods
In this study, THP-1-Dual™ and A549-Dual™ cell lines were utilized for various assays, including reporter assays, microscopy, and flow cytometry. The THP-1-Dual™ cell line, a human monocyte model, expresses two reporters: a secreted alkaline phosphatase (SEAP) that is activated by NF-κB and a secreted luciferase reporter responsive to IRF pathway activation. Knockout variants for MyD88, TRIF, and TLR4 were also generated in this dual-reporter background. The cells were cultured in RPMI 1640 medium supplemented with L-glutamine, HEPES, fetal bovine serum (FBS), and Pen-Strep, and maintained under standard conditions (37 °C, 5% CO₂), with selection antibiotics administered bi-weekly.
The A549-Dual™ cell line, representing human respiratory epithelial cells, was similarly cultured in DMEM supplemented with L-glutamine, FBS, and Pen-Strep under the same environmental conditions. This methodological framework establishes a robust platform for investigating the signaling pathways mediated by NF-κB and IRF in response to various stimuli in both monocyte and epithelial cell contexts.
Results
The study investigates the activation of NF-κB and IRF pathways in THP-1 monocyte-like cells by ionizable lipid nanoparticles (LNPs). The results indicate that empty ionizable LNPs, specifically LNP-1, LNP-ALC315, and LNP-SM102, significantly activate NF-κB, with LNP-1 showing the highest activation (6-7-fold increase at 48 and 72 hours). In contrast, the IRF response was less pronounced, with LNP-ALC315 and LNP-1 eliciting a 3-fold and 1.7-fold increase, respectively, at 48 hours. Notably, the absence of the ionizable lipid component in LNPs resulted in a complete loss of both NF-κB and IRF activation, underscoring the critical role of this component in mediating immune responses.
The kinetics of activation revealed that while TLR agonists induced rapid responses within 24 hours, the LNP-mediated activation peaked at 48-72 hours. Despite the continuous uptake of LNPs by THP-1 cells over time, endocytosis inhibitors did not significantly affect NF-κB or IRF activation, suggesting that while uptake occurs, it may not be essential for the initiation of these signaling pathways. Overall, the findings highlight the distinct activation profiles of ionizable LNPs in monocytes and the importance of the ionizable lipid in driving immune responses.
Discussion
The discussion section of the research paper highlights the activation of monocyte cell lines by ionizable lipid nanoparticles (LNPs), specifically focusing on the upregulation of Toll-like receptor (TLR) signaling pathways. The study demonstrates that LNP-1, among other formulations, significantly activates NF-κB and interferon regulatory factor (IRF) pathways, leading to the production of cytokines. A comprehensive transcriptomic analysis revealed 10,585 differentially expressed genes (DEGs) in THP-1 cells stimulated with LNP-1, with notable upregulation of NF-κB subunits (NFKB2 and RELB) and IRFs (IRF4 and IRF7). The findings suggest that TLR4, primarily through the MyD88 adaptor, plays a crucial role in mediating these immune responses, although other pathways may also contribute.
Interestingly, the study found that the addition of mRNA to LNPs did not enhance NF-κB or IRF activation compared to empty LNPs, indicating that the LNP itself is the primary driver of innate immune activation in the context of mRNA vaccines like BNT162b2. The research underscores the importance of the structural characteristics of ionizable lipids in modulating immune responses and suggests that optimizing these lipid formulations could enhance vaccine efficacy while minimizing adverse reactions. Overall, the study provides valuable insights into the mechanisms of LNP-mediated immune activation, emphasizing the potential for targeted modifications to improve vaccine design.