DOI: https://doi.org/10.1021/acs.analchem.5c04790
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41733240
تاريخ النشر: 2026-02-24
المؤلف: Debasmita Ghosh وآخرون
الموضوع الرئيسي: تقنيات و تطبيقات مطيافية الكتلة
نظرة عامة
تتناول هذه القسم من ورقة البحث آليات الشحن وتكوينات الطور الغازي للتركيبات الحمض النووي، وبشكل خاص تلك التي تحتوي على “خرزات” G-quadruplex مطوية متصلة بمناطق بوليثيمين غير منظمة، أثناء التأين بالرش الكهربائي (ESI). تكشف الدراسة أنه تحت قوة أيونية فسيولوجية، تظهر هذه التركيبات توزيع حالة شحن متعدد الأوضاع ومقطع عرض تصادم، مما يدل على وجود مجموعات شكلية متعددة. وهذا يتناقض مع الملفات الأحادية الوضع التي تُرى عادة في أوليغونوكليوتيدات أقصر. تدعم النتائج قابلية تطبيق آلية طرد الخرز (BEM) لحالات الشحن المتوسطة، إلى جانب نموذج بقايا الشحن (CRM) لحالات الشحن المنخفضة ونموذج طرد السلسلة (CEM) لحالات الشحن العالية أو التسلسلات التي تحتوي على زوائد ثيميدين.
تؤكد الاستنتاجات المستخلصة على أهمية BEM في تعزيز مستويات الشحن أثناء تحليل الطيف الكتلي الأصلي (MS) للحمض النووي في المحلول. تم تحديد نسبة الشحن إلى الفوسفات المثلى لتمييز الطيات في المحلول بناءً على دراسات مقطع العرض التصادمي على أنها $0.25 < z/P < 0.35$. كما تسلط الدراسة الضوء على أن حالات الشحن المنخفضة، التي تُفضل غالبًا في طرق MS الأصلية التقليدية، قد تؤدي إلى تفاعلات غير أصلية بين المناطق المطوية وغير المنظمة، مما يؤدي إلى هياكل مضغوطة غير قابلة للتمييز. تشير الأبحاث إلى أنه بينما يمكن تحقيق ضبط حالة الشحن من خلال تقليل القوة الأيونية أو عوامل الشحن الفائق، فإن الأولى أكثر فعالية. بالإضافة إلى ذلك، يُنصح بالحذر في تفسير النتائج، خاصةً للتركيبات مثل TnG4Tn، حيث قد لا تحافظ BEM بشكل كافٍ على المجالات المطوية. يُشجع على إجراء تحقيقات مستقبلية لاستكشاف تأثير تسلسلات المناطق غير المنظمة وقابلية تطبيق هذه النماذج على طيات الحمض النووي الأخرى.
مقدمة
تناقش المقدمة أهمية التأين بالرش الكهربائي (ESI) الطيف الكتلي (MS) في الحفاظ على تفاعلات الجزيئات الحيوية أثناء انتقالها من المحلول إلى الطور الغازي. على الرغم من تقديمه قبل أكثر من ثلاثين عامًا، لا تزال الآليات الكامنة وراء شحن الأيونات وإزالة الماء في ESI مثيرة للجدل، مع ثلاثة نماذج رئيسية: نموذج تبخر الأيون (IEM) للأيونات الصغيرة، نموذج بقايا الشحن (CRM) للمواد التحليلية الكبيرة الكروية، ونموذج طرد السلسلة (CEM) للبوليمرات غير المنظمة. يبرز المؤلفون آلية وسيطة، وهي آلية طرد الخرز (BEM)، التي تنطبق على البروتينات العلاجية متعددة المجالات وتقترح أن توزيع حالة الشحن (CSD) للحمض النووي أثناء ESI يتأثر أكثر بعملية التأين من حالة طيها في المحلول.
تهدف الدراسة إلى التحقيق فيما إذا كانت BEM قابلة للتطبيق على الحمض النووي الأطول في وضع الأيون السالب، باستخدام G-quadruplexes كنظم نموذجية. يشير المؤلفون إلى أن هيكل واستقرار G-quadruplexes يتأثران بالتنسيق المحدد للأيونات الموجبة، مثل الأمونيوم والبوتاسيوم، داخل رباعيات الجوانين. قاموا بتصميم هياكل حمض نووي مختلطة تحتوي على كل من تسلسلات G-quadruplex و بوليثيمين غير المنظمة، مع دراسة الكثافة الغازية وآليات التأين من خلال MS الحركة الأيونية الأصلية. تضمنت الإعدادات التجريبية تحضيرًا دقيقًا لـ G-quadruplexes وتسلسلات التحكم، مع التركيز على فهم كيفية تأثير وجود الأيونات والترتيب الهيكلي على عملية التأين أثناء ESI.
مناقشة
في هذا القسم، يناقش المؤلفون المنهجيات والنتائج المتعلقة باستقرار وتوصيف الهيكل لـ G-quadruplex (G4) الحمض النووي باستخدام مطيافية الأشعة فوق البنفسجية وقياس الطيف الكتلي للحركة الأيونية (IM-MS). تم تقييم استقرار هياكل G4 من خلال تجارب الانحلال الحراري، مما يكشف عن درجات حرارة انصهار لمختلف التركيبات، حيث أظهرت G4Tn و TnG4 درجات حرارة انصهار تبلغ 62 درجة مئوية و 58 درجة مئوية، على التوالي. تسلط الدراسة الضوء على توزيعات حالة الشحن متعددة الأوضاع (CSDs) التي لوحظت في أوليغونوكليوتيدات 60-mer، مما يشير إلى أنه على الرغم من كونها مطوية في المحلول، يمكن أن تتبنى هذه التركيبات تكوينات متعددة في الطور الغازي، متأثرة بالقوة الأيونية ووجود المناطق غير المنظمة.
يستفيض المؤلفون في شرح آليات التأين أثناء التأين بالرش الكهربائي (ESI)، مقترحين استمرارية بين نماذج بقايا الشحن (CRM)، ونماذج طرد الخرز (BEM)، ونماذج طرد الشحن (CEM). يجدون أن القوة الأيونية العالية تفضل CRM، بينما تعزز القوة الأيونية المنخفضة BEM، مما يؤدي إلى حالات شحن أعلى وهياكل ممتدة. من الملاحظ أن وجود مجالات G4 المطوية في كلا الطرفين يميل إلى استقرار الهياكل المضغوطة، بينما تسهل المناطق غير المنظمة تشكيل التكوينات الممتدة. تختتم الدراسة بأن BEM يمكن أن تعزز بشكل فعال مستويات الشحن في دراسات MS الأصلية للحمض النووي، مقترحة أن نسبة الشحن إلى الفوسفات 0.25 < $z/P$ < 0.35 هي المثلى لتمييز الطيات في المحلول بناءً على تحليلات مقطع العرض التصادمي. تؤكد النتائج على تعقيد هياكل الحمض النووي في الطور الغازي والحاجة إلى تفسير دقيق للنتائج، خاصة عند استخدام عوامل الشحن الفائق أو تغيير القوى الأيونية.
DOI: https://doi.org/10.1021/acs.analchem.5c04790
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41733240
Publication Date: 2026-02-24
Author(s): Debasmita Ghosh et al.
Primary Topic: Mass Spectrometry Techniques and Applications
Overview
This section of the research paper investigates the charging mechanisms and gas-phase conformations of nucleic acid constructs, specifically those featuring folded G-quadruplex “beads” connected by unstructured polythymine regions, during electrospray ionization (ESI). The study reveals that under physiological ionic strength, these constructs exhibit a multimodal charge-state and collision cross-section distribution, indicating the presence of multiple conformational ensembles. This contrasts with the unimodal profiles typically seen in shorter oligonucleotides. The findings support the applicability of the bead ejection mechanism (BEM) for intermediate charge states, alongside the charge residue model (CRM) for low charge states and the chain ejection model (CEM) for high charge states or sequences with thymine overhangs.
The conclusions drawn emphasize the significance of the BEM in enhancing charge levels during native mass spectrometry (MS) analysis of nucleic acids in solution. The optimal charge-to-phosphate ratio for distinguishing solution folds based on collision cross-section studies is identified as $0.25 < z/P < 0.35$. The study also highlights that lower charge states, often favored in traditional native MS approaches, may lead to non-native interactions between folded and unstructured regions, resulting in indistinguishable compact structures. The research suggests that while charge state tuning can be achieved through ionic strength reduction or supercharging agents, the former is more effective. Additionally, caution is advised in interpreting results, particularly for constructs like TnG4Tn, where the BEM may not adequately preserve folded domains. Future investigations are encouraged to explore the influence of unstructured region sequences and the applicability of these models to other nucleic acid folds.
Introduction
The introduction discusses the significance of native electrospray ionization (ESI) mass spectrometry (MS) in preserving the interactions of biomolecules during their transition from solution to the gas phase. Despite its introduction over thirty years ago, the mechanisms underlying ion charging and desolvation in ESI remain contentious, with three primary models: the ion evaporation model (IEM) for small ions, the charge residue model (CRM) for large globular analytes, and the chain ejection model (CEM) for disordered polymers. The authors highlight an intermediate mechanism, the bead ejection mechanism (BEM), which applies to multi-domain therapeutic proteins and suggests that the charge state distribution (CSD) of nucleic acids during ESI is influenced more by the ionization process than by their solution folding state.
The study aims to investigate whether the BEM is applicable to longer nucleic acids in negative ion mode, using G-quadruplexes as model systems. The authors note that the structure and stability of G-quadruplexes are influenced by the specific coordination of cations, such as ammonium and potassium, within guanine quartets. They designed mixed nucleic acid structures containing both G-quadruplex and unstructured polythymine sequences, examining the gas-phase compactness and ionization mechanisms through native ion mobility MS. The experimental setup involved careful preparation of G-quadruplexes and control sequences, with a focus on understanding how the presence of cations and the structural arrangement affect the ionization process during ESI.
Discussion
In this section, the authors discuss the methodologies and findings related to the stability and structural characterization of G-quadruplex (G4) nucleic acids using UV spectroscopy and ion mobility mass spectrometry (IM-MS). The stability of G4 structures was assessed through thermal denaturation experiments, revealing melting temperatures for various constructs, with G4Tn and TnG4 exhibiting melting temperatures of 62°C and 58°C, respectively. The study highlights the multimodal charge state distributions (CSDs) observed in 60-mer oligonucleotides, indicating that despite being folded in solution, these constructs can adopt multiple gas-phase conformations, influenced by ionic strength and the presence of unstructured regions.
The authors further elaborate on the mechanisms of ionization during electrospray ionization (ESI), proposing a continuum between charge residue models (CRM), bead ejection models (BEM), and charge ejection models (CEM). They find that high ionic strength favors CRM, while lower ionic strength promotes BEM, leading to higher charge states and extended structures. Notably, the presence of folded G4 domains at both termini tends to stabilize compact structures, while unstructured regions facilitate the formation of extended conformations. The study concludes that the BEM can effectively enhance charge levels in native MS studies of nucleic acids, suggesting that a charge-to-phosphate ratio of 0.25 < $z/P$ < 0.35 is optimal for distinguishing solution folds based on collision cross-section analyses. The findings underscore the complexity of gas-phase structures of nucleic acids and the need for careful interpretation of results, particularly when using supercharging agents or varying ionic strengths.