DOI: https://doi.org/10.3389/fvets.2025.1570220
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40612150
تاريخ النشر: 2025-06-19
المؤلف: Xingya Wang وآخرون
الموضوع الرئيسي: بروسيلا: التشخيص، الوبائيات، العلاج
نظرة عامة
تركز البحث على تطوير طريقة تشخيصية للكشف بشكل محدد عن العدوى الناتجة عن سلالة لقاح بروسلا S2، وهو أمر حاسم بسبب عدم قدرة الاختبارات المصلية الحالية على التمييز بين عدوى S2 وعدوى بروسلا من النوع البري. استخدمت الدراسة اثنين من المجسات تستهدف مواقع تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة (SNP) upstream لجين ABC السكر، باستخدام تقنيات تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) وتفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي بالقطرات (ddPCR). أظهرت النتائج أن كلا الطريقتين أظهرتا خصوصية عالية، حيث أظهرت MGB-SNPdd حساسية متفوقة. علاوة على ذلك، فإن تقليل التداخل بين تسلسلات المجسات والهياكل المؤقتة للغصن الحلقي عزز بشكل كبير حساسية الكشف.
تؤكد الخاتمة على فعالية طريقة ddPCR المعتمدة على SNP في تحديد عدوى سلالة لقاح بروسلا S2، خاصة في السياقات البيطرية حيث يحدث التعرض المهني للحيوانات المصابة. لا تساعد هذه الطريقة فقط في التشخيص الدقيق ولكنها تساعد أيضًا في منع الخسائر الاقتصادية في إدارة الماشية من خلال تجنب التشخيص الخاطئ والذبح غير الضروري. تؤكد النتائج على أهمية تحسين تصميم المجسات لتحسين كفاءة تضخيم PCR وحساسية الكشف.
مقدمة
تتناول مقدمة هذه الورقة البحثية التحدي الكبير الذي يشكله داء البروسيلات على الصحة العامة، وهو عدوى حيوانية المنشأ تسببها أنواع بروسلا، مع الإبلاغ عن أكثر من 500,000 حالة جديدة سنويًا، خاصة في مناطق مثل أمريكا الجنوبية وأفريقيا والشرق الأوسط وآسيا. في الصين، أظهر معدل حدوث داء البروسيلات اتجاهًا مقلقًا نحو الارتفاع من 2006 إلى 2021، مما أدى إلى تسجيل أعلى معدل حدوث بلغ 4.95 حالة لكل 100,000 نسمة في عام 2021. تظل التطعيمات استراتيجية حاسمة للسيطرة على المرض في الماشية، ومع ذلك، فإن اللقاحات الحالية، بما في ذلك سلالة B. suis S2، تقدم تحديات مثل السمية العالية والأعراض التي لا يمكن تمييزها عن العدوى الطبيعية، مما يعقد التشخيص والإدارة.
تسلط الدراسة الضوء على الحاجة الملحة لتحسين طرق التشخيص للتمييز بين العدوى الناتجة عن سلالة لقاح S2 وسلالات بروسلا من النوع البري، خاصة في المناطق ذات المعدلات العالية مثل منغوليا الداخلية. تعتبر الاختبارات المصلية الحالية غير كافية بسبب التشابه الجيني بين السلالات، مما يؤدي إلى صعوبات في تحديد داء البروسيلات المهني بين موظفي السيطرة على الأمراض الحيوانية. لمعالجة هذه الفجوة، طورت الدراسة نهجًا تشخيصيًا جديدًا باستخدام مجسات TaqMan-MGB وAffinity Plus تستهدف تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة (SNPs) المحددة في جين ABC السكر. أنشأت الدراسة بنجاح طريقة PCR الرقمية بالقطرات (ddPCR) عالية الحساسية للكشف عن عدوى سلالة لقاح S2، مما يبرز أهمية مراعاة الهياكل الثانوية للمجسات والبرايمرات في تعزيز كفاءة تضخيم PCR لتطبيقات التشخيص المستقبلية.
طرق
في هذه الدراسة، تم تحليل التسلسلات الجينومية لـ 30 سلالة من بروسلا، بما في ذلك 22 سلالة من النوع البري وسلالات اللقاح، لتحديد تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة (SNPs) المرتبطة بسلالة لقاح بروسلا S2. كشفت التحليلات عن خمسة مواقع SNP فريدة لسلالة S2، مع مقارنات التسلسل التي تشير إلى الحفاظ العالي بين السلالات غير S2. شملت الدراسة أيضًا سلالات معزولة من الخنازير وسلطت الضوء على تسلسل سلالات بروسلا من النوع البري السائدة في تونغلياو، منغوليا الداخلية، والتي تم إيداعها في GenBank.
تم تقييم القابلية السريرية لطرق PCR الكمي (qPCR) وPCR الرقمي بالقطرات (ddPCR) باستخدام نهج جديد للفلوريسنس في الوقت الحقيقي RPA-CRISPR/Cas12a. أظهر اختبار 50 عينة دم، بما في ذلك ضوابط إيجابية لسلالات S2 وCIT21 من النوع البري، أن اختبار MGB-SNPdd حقق معدل كشف 100% للسلالة من النوع البري، بينما أشار إشارة FAM إلى وجود سلالة S2 في عينتين. كشفت تحليل منحنى ROC أن طريقة MGB-SNPdd أظهرت أعلى أداء تشخيصي بين الطرق المختبرة، مع منطقة تحت المنحنى تبلغ 0.845 وحساسية تبلغ 73.9%. بشكل عام، تؤكد النتائج على خصوصية وفعالية طرق الكشف المطورة للتمييز بين سلالات اللقاح S2 وسلالات النوع البري.
مناقشة
تركز الدراسة على تطوير طرق تشخيصية حساسة ومحددة للكشف عن الحمض النووي لبروسلا، خاصة من سلالة لقاح S2، في عينات سريرية من مرضى داء البروسيلات. باستخدام المعايير التشخيصية من اللجنة الوطنية للصحة في الصين، تم تحليل عينات دم من 50 مريضًا باستخدام تقنيات جزيئية متقدمة، بما في ذلك PCR الكمي (qPCR) وPCR الرقمي بالقطرات (ddPCR). تبرز الدراسة تصميم البرايمرات والمجسات بناءً على تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة (SNPs) في جين ABC السكر، والتي تميز بشكل فعال سلالة لقاح S2 عن سلالات بروسلا الأخرى. أظهرت النتائج أن طريقة MGB-SNPdd أظهرت أعلى حساسية، مع حد كشف يبلغ 10 نسخ/μL لكل من سلالات لقاح S2 وسلالات CIT21 من النوع البري.
تؤكد المناقشة على التحديات المتعلقة بالتشخيص الدقيق لداء البروسيلات بسبب التشابه السريري للمرض مع عدوى أخرى وقيود الطرق المصلية التقليدية. تجادل الدراسة بضرورة وجود تشخيصات جزيئية موثوقة للتمييز بين المناعة الناتجة عن اللقاح والعدوى الطبيعية، خاصة في المناطق المتوطنة مثل منغوليا الداخلية. تشير النتائج إلى أن طرق الكشف المعتمدة على SNP المطورة، وخاصة ddPCR، تقدم مزايا كبيرة على التقنيات التقليدية من خلال تقليل تأثير المثبطات وتوفير قياس دقيق دون الحاجة إلى منحنيات معيارية. يعد هذا التقدم أمرًا حيويًا لتحسين التشخيص المبكر وإدارة داء البروسيلات، مما يساعد في النهاية في جهود الصحة العامة للسيطرة على المرض.
DOI: https://doi.org/10.3389/fvets.2025.1570220
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40612150
Publication Date: 2025-06-19
Author(s): Xingya Wang et al.
Primary Topic: Brucella: diagnosis, epidemiology, treatment
Overview
The research focuses on developing a diagnostic method to specifically detect infections caused by the Brucella S2 vaccine strain, which is crucial due to the inability of current serological assays to differentiate between S2 and wild-type Brucella infections. The study employed two probes targeting single nucleotide polymorphism (SNP) loci upstream of the sugar ABC gene, utilizing quantitative polymerase chain reaction (qPCR) and droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) techniques. Results indicated that both methods exhibited high specificity, with the MGB-SNPdd demonstrating superior sensitivity. Furthermore, minimizing the overlap between probe sequences and transient stem-loop structures significantly enhanced detection sensitivity.
The conclusion emphasizes the effectiveness of the SNP-based ddPCR method for identifying Brucella S2 vaccine strain infections, particularly in veterinary contexts where occupational exposure to infected animals occurs. This method not only aids in accurate diagnosis but also helps prevent economic losses in livestock management by avoiding misidentification and unnecessary culling. The findings underscore the importance of optimizing probe design to improve PCR amplification efficiency and detection sensitivity.
Introduction
The introduction of this research paper addresses the significant public health challenge posed by brucellosis, a zoonotic infection caused by Brucella species, with over 500,000 new cases reported annually, particularly in regions such as South America, Africa, the Middle East, and Asia. In China, brucellosis incidence has shown a concerning upward trend from 2006 to 2021, culminating in a record-high incidence rate of 4.95 cases per 100,000 population in 2021. Vaccination remains a critical strategy for controlling the disease in livestock, yet existing vaccines, including the B. suis strain S2, present challenges such as high toxicity and indistinguishable symptoms from natural infections, complicating diagnosis and management.
The study highlights the urgent need for improved diagnostic methods to differentiate between infections caused by the S2 vaccine strain and wild-type Brucella strains, particularly in high-incidence areas like Inner Mongolia. Current serological tests are inadequate due to the genetic similarity between the strains, leading to difficulties in identifying occupational brucellosis among animal disease control personnel. To address this gap, the research developed a novel diagnostic approach utilizing TaqMan-MGB and Affinity Plus probes targeting specific single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the sugar ABC gene. The study successfully established a highly sensitive droplet digital PCR (ddPCR) method for detecting S2 vaccine strain infections, emphasizing the importance of considering probe and primer secondary structures in enhancing PCR amplification efficiency for future diagnostic applications.
Methods
In this study, the genomic sequences of 30 Brucella strains, including 22 wild-type and vaccine strains, were analyzed to identify specific single nucleotide polymorphisms (SNPs) associated with the Brucella S2 vaccine strain. The analysis revealed five SNP loci unique to the S2 strain, with sequence comparisons indicating high conservation among the non-S2 strains. The study also included strains isolated from pigs and highlighted the sequencing of Brucella wild-type strains prevalent in Tongliao, Inner Mongolia, which were deposited in GenBank.
The clinical applicability of quantitative PCR (qPCR) and droplet digital PCR (ddPCR) methods was evaluated using a novel RPA-CRISPR/Cas12a real-time fluorescence approach. Testing of 50 blood samples, including positive controls for the S2 and CIT21 wild-type strains, demonstrated that the MGB-SNPdd assay achieved a 100% detection rate for the wild-type strain, while the FAM signal indicated the presence of the S2 strain in two samples. ROC curve analysis revealed that the MGB-SNPdd method exhibited the highest diagnostic performance among the tested methods, with an area under the curve of 0.845 and a sensitivity of 73.9%. Overall, the findings confirm the specificity and efficacy of the developed detection methods for distinguishing between the S2 vaccine and wild-type strains.
Discussion
The study focuses on developing sensitive and specific diagnostic methods for detecting Brucella DNA, particularly from the S2 vaccine strain, in clinical samples of brucellosis patients. Utilizing the diagnostic criteria from the National Health Commission of China, blood samples from 50 patients were analyzed using advanced molecular techniques, including quantitative PCR (qPCR) and droplet digital PCR (ddPCR). The study highlights the design of primers and probes based on single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the sugar ABC gene, which effectively differentiate the S2 vaccine strain from other Brucella strains. The results demonstrated that the MGB-SNPdd method exhibited the highest sensitivity, with a detection limit of 10 copies/μL for both the S2 vaccine and CIT21 wild-type strains.
The discussion emphasizes the challenges of accurately diagnosing brucellosis due to the disease’s clinical similarities with other infections and the limitations of conventional serological methods. The study argues for the necessity of reliable molecular diagnostics to distinguish between vaccine-induced immunity and natural infections, particularly in endemic regions like Inner Mongolia. The findings suggest that the developed SNP-based detection methods, particularly ddPCR, offer significant advantages over traditional techniques by reducing the impact of inhibitors and providing precise quantification without the need for standard curves. This advancement is crucial for improving early diagnosis and management of brucellosis, ultimately aiding in public health efforts to control the disease.