DOI: https://doi.org/10.1038/s41380-025-02997-z
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40188316
تاريخ النشر: 2025-04-05
المؤلف: Olivia M. Teter وآخرون
الموضوع الرئيسي: آليات الالتهاب العصبي والتنكس العصبي
نظرة عامة
تناقش هذه الفقرة التحقيق في اضطرابات طيف التوحد (ASD) من خلال عدسة الجينوم الوظيفي، مع التركيز بشكل خاص على دور جينات خطر ASD في الخلايا الدبقية الصغيرة، وهي خلايا المناعة المقيمة في الدماغ. بينما ركزت الدراسات السابقة بشكل أساسي على الخلايا العصبية وخلايا السلف العصبية، يبرز هذا البحث أهمية مشاركة الخلايا الدبقية الصغيرة في ASD، مدعومًا بأدلة على تنشيطها في عينات الأنسجة بعد الوفاة.
باستخدام تدخل CRISPR (CRISPRi)، قام المؤلفون بتقييم منهجي لتأثيرات تقليل جينات خطر ASD على تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة والبلعمة. أنشأوا نظام زراعة مشترك للخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية المشتقة من خلايا جذعية متعددة القدرات (iPSC)، مقترنًا بتقنية قياس التدفق عالية الإنتاجية، لتسهيل فحص البلعمة وتقليم المشابك. من الجدير بالذكر أن الدراسة حددت ADNP، وهو جين خطر بارز في ASD، كمنظم رئيسي لتقليم المشابك في الخلايا الدبقية الصغيرة. كشفت النتائج أن الخلايا الدبقية الصغيرة التي تفتقر إلى ADNP أظهرت تغيرات في النقل الداخلي، وتغيرات في ملفات البروتين، وزيادة في الحركة داخل بيئة الزراعة المشتركة.
مقدمة
تناقش مقدمة هذه الورقة البحثية اضطراب طيف التوحد (ASD) كحالة عصبية تنموية معقدة تتميز بنقص في التواصل الاجتماعي والتواصل، إلى جانب سلوكيات متكررة. تبرز المشاركة لكل من العوامل الوراثية والبيئية في ASD، مع التأكيد على الأنماط التنموية العصبية المشتركة مثل كثافة المشابك المتغيرة وتنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة. قد تظهر الخلايا الدبقية الصغيرة، التي تلعب أدوارًا حاسمة في تطوير الدماغ وتنظيم المناعة، وظائف متغيرة في ASD، على الرغم من أنه لا يزال غير واضح ما إذا كان تنشيطها استجابة للإشارات العصبية غير الطبيعية أو خاصية داخلية.
تهدف الدراسة إلى التحقيق في دور جينات خطر ASD في الخلايا الدبقية الصغيرة باستخدام تدخل CRISPR (CRISPRi) لنمذجة نقص الهيموغلوبين، وهو شائع في ASD بسبب الطفرات المسببة لفقدان الوظيفة. من خلال استخدام تسلسل الخلايا المفردة واختبار جديد قائم على قياس التدفق لتقليم المشابك، حدد الباحثون تغييرات في ملف تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة عند تقليل عدد جينات خطر ASD المختلفة. من الجدير بالذكر أن الجين ADNP وُجد أنه ينظم تقليم المشابك بشكل خاص، حيث أدى تقليله إلى تعطيل النقل الداخلي وتغيرات في التفاعلات بين الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية. يبرز هذا العمل التأثير المحتمل لتعطيل جينات خطر ASD على وظيفة الخلايا الدبقية الصغيرة ودورها في العمليات التنموية العصبية.
الطرق
تحدد فقرة “المواد والطرق” تصميم التجربة والإجراءات المستخدمة في الدراسة. توضح المواد المستخدمة، بما في ذلك الكواشف المحددة، والمعدات، وأي عينات بيولوجية. يتم وصف المنهجية بطريقة منهجية، مع تسليط الضوء على البروتوكولات المتبعة لجمع البيانات وتحليلها. يتضمن ذلك أي طرق إحصائية تم تطبيقها لضمان صحة وموثوقية النتائج.
علاوة على ذلك، قد تتوسع الفقرة في إعداد التجربة، بما في ذلك تدابير التحكم والظروف التي أجريت فيها التجارب. من الضروري أن يتم وصف الطرق بتفصيل كافٍ لضمان إمكانية تكرار الدراسة من قبل باحثين آخرين. بشكل عام، تعتبر هذه الفقرة أساسًا لفهم النتائج البحثية المقدمة في الأقسام اللاحقة.
النتائج
تكشف نتائج هذه الدراسة أن مجموعة فرعية من جينات خطر اضطراب طيف التوحد (ASD) يتم التعبير عنها في الخلايا الدبقية الصغيرة، وأن الاضطرابات في هذه الجينات يمكن أن تغير بشكل كبير حالات التنشيط للخلايا الدبقية الصغيرة المشتقة من خلايا جذعية متعددة القدرات (iPSC) (iTF-Microglia). أشار تحليل مجموعة بيانات تسلسل الخلايا المفردة إلى أنه بينما يتم التعبير عن العديد من جينات خطر ASD بشكل أساسي في الخلايا العصبية المثيرة، يتم التعبير عن العديد منها بشكل متساوٍ في الخلايا الدبقية الصغيرة، وخاصة تلك المرتبطة بمسارات تنظيم الجينات. باستخدام تدخل CRISPR (CRISPRi) لتقليل 53 من هذه الجينات في iTF-Microglia، حددت الدراسة خمس حالات نسخ متميزة، بما في ذلك حالات الكيموكين والإنترفيرون، مع تغييرات ملحوظة في حالات التنشيط المرتبطة بتقليل جينات معينة، مثل ADNP وTRIP12.
علاوة على ذلك، طورت البحث اختبارًا عالي الإنتاجية لتقييم دور جينات خطر ASD في تقليم المشابك في الخلايا الدبقية الصغيرة، وهي عملية حاسمة في التطور العصبي. استخدم الاختبار خلايا عصبية مهندسة تعبر عن علامة مشبكية فلورية لقياس امتصاص المواد المشبكية بواسطة iTF-Microglia. أظهرت النتائج أن iTF-Microglia قامت بامتصاص المواد المشبكية بشكل انتقائي، حيث أدى تقليل ADNP إلى زيادة امتصاص المشابك الحية. كشفت التحليلات البروتينية أن فقدان ADNP أثر على بروتينات سطح الخلايا الدبقية الصغيرة والنقل الداخلي، مما يشير إلى أن ADNP يلعب دورًا حاسمًا في تعديل تفاعلات الخلايا الدبقية الصغيرة مع الخلايا العصبية والمواد المشبكية، مما قد يسهم في علم الأمراض المرتبطة بـ ASD.
المناقشة
في هذه الفقرة، يوضح المؤلفون المنهجيات المستخدمة لزراعة وتمايز خلايا جذعية متعددة القدرات البشرية (iPSCs) إلى خلايا دبقية صغيرة وخلايا عصبية، بالإضافة إلى التجارب المشتركة اللاحقة. تم الحفاظ على iPSCs في حاويات مغطاة بمادة ماتريجيل وتم تمايزها إلى خلايا دبقية صغيرة مشتقة من iPSC (iTF-Microglia) وخلايا عصبية (iNeurons) باستخدام وسائط محددة وعوامل نمو. تم هندسة iTF-Microglia للتعبير عن عوامل النسخ القابلة للتحفيز بواسطة الدوكسيسيكلين وآلية تدخل CRISPR (CRISPRi)، بينما تم اشتقاق iNeurons من iPSCs NGN2. تم إنشاء الزراعة المشتركة بين iTF-Microglia وiNeurons بنسبة محددة، مما يسمح بالتحقيق في التفاعلات بين هذين النوعين من الخلايا.
كما يصف المؤلفون إعداد الفيروسات المعوية لتعديل تعبير الجينات وهندسة تراكيب محددة للتصوير الحي واختبارات امتصاص المشابك. استخدموا قياس التدفق لتحليل امتصاص المواد المشبكية بواسطة الخلايا الدبقية الصغيرة وأجروا تسلسل كمي (Quant-seq) لتوصيف ملفات التعبير الجيني في الخلايا المزروعة معًا. توفر المنهجيات الموضحة إطارًا شاملاً لدراسة ديناميات التفاعلات بين الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية والآثار الوظيفية لتقليل جينات معينة في سياق الاضطرابات التنموية العصبية.
DOI: https://doi.org/10.1038/s41380-025-02997-z
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40188316
Publication Date: 2025-04-05
Author(s): Olivia M. Teter et al.
Primary Topic: Neuroinflammation and Neurodegeneration Mechanisms
Overview
This section discusses the investigation of Autism Spectrum Disorders (ASD) through the lens of functional genomics, particularly focusing on the role of ASD risk genes in microglia, the brain’s resident immune cells. While previous studies have primarily concentrated on neurons and neural progenitor cells, this research highlights the significance of microglial involvement in ASD, supported by evidence of their activation in postmortem tissue samples.
Utilizing CRISPR interference (CRISPRi), the authors systematically evaluated the effects of knocking down ASD risk genes on microglial activation and phagocytosis. They established an induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived microglia-neuron coculture system, coupled with high-throughput flow cytometry, to facilitate the screening of phagocytosis and synaptic pruning. Notably, the study identified ADNP, a prominent ASD risk gene, as a key modulator of microglial synaptic pruning. The findings revealed that microglia lacking ADNP exhibited altered endocytic trafficking, changes in proteomic profiles, and increased motility within the coculture environment.
Introduction
The introduction of this research paper discusses Autism Spectrum Disorder (ASD) as a complex neurodevelopmental condition characterized by social and communication deficits, alongside repetitive behaviors. It highlights the involvement of both genetic and environmental factors in ASD, emphasizing shared neurodevelopmental patterns such as altered synaptic density and microglial activation. Microglia, which play crucial roles in brain development and immune regulation, may exhibit altered functions in ASD, although it remains unclear whether their activation is a response to abnormal neuronal signals or an intrinsic property.
The study aims to investigate the role of ASD risk genes in microglia using CRISPR interference (CRISPRi) to model haploinsufficiency, which is common in ASD due to heterozygous loss-of-function mutations. By employing single-cell sequencing and a novel flow cytometry-based assay for synaptic pruning, the researchers identified changes in the activation profile of microglia upon knockdown of various ASD risk genes. Notably, the gene ADNP was found to specifically regulate synaptic pruning, with its knockdown leading to disrupted endocytic trafficking and altered microglial-neuronal interactions. This work underscores the potential impact of ASD risk gene disruption on microglial function and their role in neurodevelopmental processes.
Methods
The “Materials and Methods” section outlines the experimental design and procedures employed in the study. It details the materials used, including specific reagents, equipment, and any biological samples. The methodology is described in a systematic manner, highlighting the protocols followed for data collection and analysis. This includes any statistical methods applied to ensure the validity and reliability of the results.
Furthermore, the section may elaborate on the experimental setup, including control measures and the conditions under which the experiments were conducted. It is crucial for reproducibility that the methods are described with sufficient detail, allowing other researchers to replicate the study. Overall, this section serves as a foundation for understanding the research findings presented in subsequent sections.
Results
The results of this study reveal that a subset of autism spectrum disorder (ASD) risk genes is expressed in microglia, and perturbations in these genes can significantly alter the activation states of induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived microglia (iTF-Microglia). Analysis of a single-cell sequencing dataset indicated that while many ASD risk genes are predominantly expressed in excitatory neurons, several are comparably expressed in microglia, particularly those associated with gene regulatory pathways. Using CRISPR interference (CRISPRi) to knock down 53 of these genes in iTF-Microglia, the study identified five distinct transcriptomic states, including chemokine and interferon states, with notable shifts in activation states linked to specific gene knockdowns, such as ADNP and TRIP12.
Furthermore, the research developed a high-throughput assay to assess the role of ASD risk genes in microglial synaptic pruning, a crucial process in neurodevelopment. The assay utilized engineered neurons expressing a fluorescent synaptic marker to measure the uptake of synaptic material by iTF-Microglia. Results demonstrated that iTF-Microglia selectively internalized synaptic material, with ADNP knockdown leading to increased uptake of live synapses. Proteomic analyses revealed that ADNP loss affected microglial surface proteins and endocytic trafficking, suggesting that ADNP plays a critical role in modulating microglial interactions with neurons and synaptic material, potentially contributing to the pathophysiology of ASD.
Discussion
In this section, the authors detail the methodologies employed for the culture and differentiation of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into microglia and neurons, as well as the subsequent coculture experiments. iPSCs were maintained on Matrigel-coated vessels and differentiated into iPSC-derived microglia (iTF-Microglia) and neurons (iNeurons) using specific media and growth factors. The iTF-Microglia were engineered to express doxycycline-inducible transcription factors and CRISPR interference (CRISPRi) machinery, while iNeurons were derived from NGN2-iPSCs. The coculture of iTF-Microglia and iNeurons was established at a defined ratio, allowing for the investigation of interactions between these cell types.
The authors also describe the preparation of lentiviruses for gene expression manipulation and the engineering of specific constructs for live imaging and synaptic uptake assays. They utilized flow cytometry to analyze the uptake of synaptic materials by microglia and conducted quantitative sequencing (Quant-seq) to characterize gene expression profiles in cocultured cells. The methodologies outlined provide a comprehensive framework for studying the dynamics of microglial-neuronal interactions and the functional implications of specific gene knockdowns in the context of neurodevelopmental disorders.