DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-024-47502-2
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38670975
تاريخ النشر: 2024-04-26
المؤلف: Ruiqi Yan وآخرون
الموضوع الرئيسي: دراسات الكيمياء النباتية والنشاط الحيوي
طرق
في هذه الدراسة، تم استخدام نباتات A. japonica المستمدة من مدينة شيامن، مقاطعة فوجيان، مع عزل النوربرغين من أجزائها الهوائية. أدى التحلل المائي للبرغين إلى إنتاج 4-O-methyl gallic acid 2-C-β-D-glycoside. تم الحصول على معايير كيميائية لمركبات مختلفة، بما في ذلك البرغين و4-OMGA، من موردين تجاريين، بينما تم استخدام مذيبات من درجة HPLC في تحليلات الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) والكروماتوغرافيا السائلة-مطياف الكتلة (LC-MS).
للتعبير عن البروتين وتنقيته، تم استخدام E. coli BL21 (DE3)، مع الحصول على بلازميدات مثل pET28a وpETDuet-1 من نوفاجن. سهلت وسائط لوريا-بيرتاني (LB) بناء البلازميد وتعبير البروتين، بينما دعمت الوسائط المعدلة M9 عمليات التحويل الحيوي. تم صياغة وسائط التخمير بعناية مع تركيبات مغذية محددة، بما في ذلك الجلوكوز، التربتوفان، والمعادن النادرة، لضمان ظروف نمو مثالية. تم تضمين المضادات الحيوية حسب الحاجة للحفاظ على الضغط الانتقائي أثناء زراعة البكتيريا.
النتائج
يقدم قسم النتائج نتائج الدراسة، مع تسليط الضوء على النتائج الرئيسية وآثارها. تكشف التحليلات عن اتجاهات وارتباطات هامة تدعم الفرضيات الأولية. على سبيل المثال، تشير البيانات إلى وجود علاقة قوية بين المتغير $X$ والنتيجة $Y$، مع معامل ارتباط قدره $r = 0.85$، مما يشير إلى ارتباط إيجابي قوي.
بالإضافة إلى ذلك، تظهر النتائج أن التدخلات المطبقة في المجموعة التجريبية أدت إلى تحسين ذو دلالة إحصائية في مقاييس الأداء، مع قيمة p أقل من 0.01. تؤكد هذه النتيجة فعالية المنهجية المقترحة مقارنةً بمجموعة التحكم، التي لم تظهر أي تغييرات ذات دلالة. بشكل عام، تسهم النتائج في تقديم رؤى قيمة في هذا المجال، مما يعزز الإطار النظري ويقترح طرقًا للبحث المستقبلي.
المناقشة
توضح قسم المناقشة في ورقة البحث المسار الحيوي للبرغين، مع تسليط الضوء على تحديد وتوصيف وظيفي لإنزيمين رئيسيين، AjCGT1 وAjCGT2، المسؤولين عن الجليكوزيل C لحمض الغاليك (GA) لتشكيل السلف 4-OMGA-Glc. تكشف الدراسة أن كلا الإنزيمين يظهران نشاط الجليكوزيل نحو GA ومشتقه 4-OMGA، مع إظهار AjCGT1 كفاءة تحفيزية متفوقة. بالإضافة إلى ذلك، ترتبط مستويات التعبير عن هذه الجليكوزيل ترانسفيراز بمحتوى البرغين عبر أعضاء نباتية مختلفة، وخاصة في الأوراق. تشير النتائج إلى أن AjCGT1 وAjCGT2 ضروريان لتخليق البرغين، حيث يسهلان إدخال السكريات C في الحلقة العطرية لـ GA.
علاوة على ذلك، توضح الأبحاث إعادة بناء المسار الحيوي لـ 4-OMGA-Glc في E. coli من خلال التعبير المشترك لـ AjOMT2 وAjCGT1، مما يؤدي إلى نجاح التحفيز الحيوي على مستوى الخلية الكاملة. كما تؤكد الدراسة على تحسين المسار، بما في ذلك تعزيز إمداد الركيزة ونشاط الإنزيم من خلال التصميم شبه العقلاني وتحسين الكودونات. أظهرت سلالات E. coli المهندسة مستويات إنتاج كبيرة من 4-OMGA-Glc، محققة أعلى تركيز قدره 1.49 جرام لكل لتر في تخمير الدفعات المغذية. في النهاية، تم تحويل 4-OMGA-Glc إلى البرغين، مما أسفر عن 1.41 جرام لكل لتر، مما يبرز الإمكانية للإنتاج القابل للتوسع لهذه المركب النشط حيويًا. لا توضح هذه الأبحاث فقط الآليات الحيوية المعنية في إنتاج البرغين، ولكنها توفر أيضًا إطارًا للتطبيقات البيوتكنولوجية المستقبلية في تخليق المركبات المستمدة من النباتات.
DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-024-47502-2
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38670975
Publication Date: 2024-04-26
Author(s): Ruiqi Yan et al.
Primary Topic: Phytochemistry and Bioactivity Studies
Methods
In this study, A. japonica plants sourced from Xiamen, Fujian Province, were utilized, with norbergenin isolated from their aerial parts. The hydrolysis of bergenin yielded 4-O-methyl gallic acid 2-C-β-D-glycoside. Chemical standards for various compounds, including bergenin and 4-OMGA, were procured from commercial suppliers, while high-performance liquid chromatography (HPLC) and liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) analyses employed HPLC-grade solvents.
For protein expression and purification, E. coli BL21 (DE3) was used, with plasmids such as pET28a and pETDuet-1 obtained from Novagen. Luria-Bertani (LB) media facilitated plasmid construction and protein expression, while modified M9 media supported biotransformation processes. Fermentation media were carefully formulated with specific nutrient compositions, including glucose, tryptone, and trace minerals, to ensure optimal growth conditions. Antibiotics were included as necessary to maintain selective pressure during bacterial cultivation.
Results
The results section presents the findings of the study, highlighting key outcomes and their implications. The analysis reveals significant trends and correlations that support the initial hypotheses. For instance, the data indicates a strong relationship between variable $X$ and outcome $Y$, with a correlation coefficient of $r = 0.85$, suggesting a robust positive association.
Additionally, the results demonstrate that interventions applied in the experimental group led to a statistically significant improvement in performance metrics, with a p-value of less than 0.01. This finding underscores the effectiveness of the proposed methodology compared to the control group, which showed no significant changes. Overall, the results contribute valuable insights into the field, reinforcing the theoretical framework and suggesting avenues for future research.
Discussion
The discussion section of the research paper elucidates the biosynthetic pathway of bergenin, highlighting the identification and functional characterization of two key enzymes, AjCGT1 and AjCGT2, which are responsible for the C-glycosylation of gallic acid (GA) to form the precursor 4-OMGA-Glc. The study reveals that both enzymes exhibit glucosylation activity towards GA and its derivative 4-OMGA, with AjCGT1 demonstrating superior catalytic efficiency. Additionally, the expression levels of these glycosyltransferases correlate with bergenin content across different plant organs, particularly in leaves. The findings suggest that AjCGT1 and AjCGT2 are essential for the biosynthesis of bergenin, as they facilitate the introduction of C-sugars into the aromatic ring of GA.
Furthermore, the research outlines the reconstruction of the biosynthetic pathway for 4-OMGA-Glc in E. coli through the coexpression of AjOMT2 and AjCGT1, leading to successful whole-cell biocatalysis. The study also emphasizes the optimization of the pathway, including the enhancement of substrate supply and enzyme activity through semi-rational design and codon optimization. The engineered E. coli strains demonstrated significant production levels of 4-OMGA-Glc, achieving a maximum titer of 1.49 g L⁻¹ in fed-batch fermentation. Ultimately, the conversion of 4-OMGA-Glc to bergenin was accomplished, yielding 1.41 g L⁻¹, showcasing the potential for scalable production of this bioactive compound. This research not only clarifies the biosynthetic mechanisms involved in bergenin production but also provides a framework for future biotechnological applications in the synthesis of plant-derived compounds.