DOI: https://doi.org/10.1038/s41392-024-01763-x
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38438346
تاريخ النشر: 2024-03-04
المؤلف: Yuanliang Yan وآخرون
الموضوع الرئيسي: إنترفيرون واستجابات المناعة
نظرة عامة
تبحث هذه الدراسة في آليات مقاومة التيموزولوميد (TMZ) في الورم الدبقي (GBM)، وهو ورم دماغي شائع وعدواني. على الرغم من أن TMZ هو علاج قياسي، فإن ظهور مقاومة الأدوية يشكل تحديات كبيرة. استخدمت الدراسة مطيافية الكتلة لتحليل ملفات البروتينات لستة أزواج من مرضى GBM، حيث تم تحديد 648 بروتينًا مع تعبير مختلف بشكل كبير بين الأورام الأولية والمتكررة. سلط تحليل إثراء مجموعة الجينات (GSEA) الضوء على التغيرات في استقلاب الدهون ومسارات الأكسدة البيولوجية، مع زيادة ملحوظة في تنظيم كيناز الإينوزيتول 1،4،5-ثلاثي الفوسفات B (ITPKB) في الأورام المتكررة، والتي ارتبطت بضعف بقاء المرضى.
كشفت التحقيقات الإضافية أن تقليل ITPKB في الخلايا المقاومة لـ TMZ زاد من أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) المرتبطة بنشاط أكسيد NADPH (NOX)، مما أعاد الحساسية لـ TMZ. أوضحت الدراسة أن تقليل الفسفرة لـ E3 ليغاس Trim25 عند موضع S100 في عينات GBM المتكررة أدى إلى تقليل يوبكويتين ITPKB، مما زاد من استقراره وأضعف إنتاج ROS. بالإضافة إلى ذلك، كان كل من تقليل ITPKB ومثبط ITPKB GNF362 فعالين في مواجهة مقاومة الكيمياء لـ TMZ في نماذج زراعة الورم الدبقي. تشير هذه النتائج إلى آلية جديدة لمقاومة TMZ وتضع ITPKB كهدف علاجي محتمل للتغلب على المقاومة في علاج GBM.
مقدمة
تسلط مقدمة ورقة البحث الضوء على التحديات المرتبطة بالورم الدبقي (GBM)، وهو أكثر الأنواع العدوانية من الورم الدبقي وأكثر الأورام الخبيثة الأولية شيوعًا في الجهاز العصبي المركزي. على الرغم من العلاج القياسي الذي يجمع بين العلاج الإشعاعي ووكيل الألكلة للحمض النووي التيموزولوميد (TMZ)، والذي أظهر زيادة متواضعة في معدلات البقاء، إلا أن التوقعات تظل سيئة بسبب حاجز الدم في الدماغ ومعدلات التكرار العالية. يعاني ما يقرب من 90% من مرضى GBM من تكرار، ولا توجد حاليًا علاجات فعالة للحالات المتكررة، مما يبرز الحاجة الملحة لفهم أعمق لعلم الأمراض الجزيئي لـ GBM وتحديد أهداف علاجية جديدة.
دور أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) في GBM معقد، حيث يمكن أن تعزز أو تثبط نمو الورم. ترتبط التأثيرات السامة لـ TMZ بزيادة مستويات ROS، وترتبط المقاومة لـ TMZ بعدم الحساسية للإجهاد التأكسدي. تناقش الورقة إمكانية استخدام بوليفيلين VII وتثبيط Sirtuin 1 لتعزيز حساسية TMZ من خلال تعديل مستويات ROS. علاوة على ذلك، تقدم كيناز الإينوزيتول-1،4،5-ثلاثي الفوسفات (IP3) B (ITPKB) كهدف جديد لمقاومة TMZ، حيث يرتبط تنظيمه الإيجابي بنتائج سيئة للمرضى. تقترح الدراسة أن تنظيم ITPKB من خلال اليوبكويتين بواسطة E3 ليغاس Trim25 قد يلعب دورًا حاسمًا في مسببات GBM واستجابة العلاج، مما يشير إلى أن استهداف ITPKB قد يحسن الفعالية العلاجية ضد GBM.
طرق البحث
في هذه الدراسة، تم زراعة وتوصيف خطوط خلايا الورم الدبقي (GBM) المختلفة، بما في ذلك HEK293T وT98G وU118 وU87، باستخدام تحديد النمط الجيني المتكرر القصير. تم تطوير متغيرات مقاومة TMZ (T98G-R وU118-R وU87-R) من خلال اختيار تدريجي مع زيادة تركيزات التيموزولوميد (TMZ). بالإضافة إلى ذلك، تم استخدام خلايا GBM الحساسة للإشعاع (U251) والمقاومة (U251-IR) لاستكشاف دور جينات الهدف المحددة في مقاومة الإشعاع. تم الحفاظ على الخلايا في وسط Eagle المعدل من ديلبيكو (DMEM) مع إضافة 10% من مصل الجنين البقري (FBS) و1% من البنسلين/ستربتوميسين.
للتحقيق في وظيفة ITPKB، تم إنشاء خطوط خلايا knockdown باستخدام ناقلات فيروسية تحتوي على تسلسلات shRNA محددة. تم الحصول على بلازميدات مختلفة تحتوي على طفرات ITPKB مع علامة العلم وTrim25 مع علامة V5 من مصادر تجارية، وتم استخدام الطفرات الموجهة لإنشاء طفرات نقطية وتقصيرات، والتي تم تأكيدها عبر تسلسل Sanger. تم استخدام مجموعة من الأجسام المضادة المستهدفة لـ ITPKB وTrim25 وبروتينات أخرى متورطة في العمليات الخلوية للتحليلات اللاحقة، جنبًا إلى جنب مع مثبطات محددة لتقييم تأثيراتها على الاستجابات الخلوية. تم إجراء العدوى الفيروسية باستخدام Lipofectamine™ 3000 للتعديل الجيني، تلتها عملية اختيار باستخدام البيروميسين لإنشاء تجمعات خلوية نقية لمزيد من التجارب.
النتائج
تسلط نتائج هذه الدراسة الضوء على ارتباط كيناز الإينوزيتول-ثلاثي الفوسفات 3 (ITPKB) بخباثة الورم الدبقي ومقاومة علاج التيموزولوميد (TMZ) في الورم الدبقي (GBM). كشفت تحليل البروتينات لستة أزواج من مرضى GBM عن اختلافات كبيرة في تعبير البروتين بين الأورام الأولية والمتكررة، حيث تم تحديد 266 بروتينًا مرتفع التعبير و382 بروتينًا منخفض التعبير. بشكل ملحوظ، كانت المسارات المتعلقة بالأكسدة البيولوجية واستقلاب الدهون غنية في الأورام المتكررة. من بين الكينازات المحددة، تم تنظيم ITPKB وITPK1 بشكل مستمر في العينات المتكررة، حيث أظهر ITPKB ارتباطًا قويًا بنتائج بقاء أسوأ في مرضى GBM.
أظهرت التحقيقات الإضافية أن تعبير ITPKB كان أعلى بشكل ملحوظ في خطوط خلايا GBM المقاومة لـ TMZ مقارنةً بالحساسة. بينما لم تختلف مستويات ITPKB بين الخلايا الحساسة للإشعاع والمقاومة، تم تحفيز تعبيره في الخلايا الحساسة عند علاجها بـ TMZ، وهو استجابة غائبة في الخلايا المقاومة. أدى تقليل ITPKB في الخطوط المقاومة لـ TMZ إلى زيادة حساسية الدواء، واستعادة التعبير عن ITPKB البري أعادت تثبيط البقاء، مما يشير إلى دوره في آليات المقاومة. بالإضافة إلى ذلك، أدى مثبط ITPKB الانتقائي GNF362، عند دمجه مع TMZ، إلى تقليل كبير في بقاء الخلايا في الخطوط المقاومة. تؤكد هذه النتائج الدور الحاسم لـ ITPKB في الوساطة لمقاومة TMZ في GBM، مما يقترح أنه هدف علاجي محتمل.
المناقشة
في هذه الدراسة، بحث المؤلفون في دور كيناز الإينوزيتول 1،4،5-ثلاثي الفوسفات 3 (ITPKB) في منح مقاومة للتيموزولوميد (TMZ) في مرضى الورم الدبقي متعدد الأشكال (GBM). تم تحليل عينات الأنسجة من ستة أزواج من GBM الأولية والمتكررة باستخدام تحليل البروتينات TMT-labeling HPLC-MS/MS، مما كشف عن تعبير بروتين مختلف بشكل كبير مرتبط بمقاومة TMZ. أكدت صبغة المناعية لـ 19 عينة إضافية من GBM وجود ITPKB، والذي وُجد أنه يرتبط إيجابيًا مع مسارات الإشارة المتعلقة بـ ROS. بشكل ملحوظ، أظهرت الخلايا المقاومة لـ TMZ مستويات مرتفعة من ROS الأساسية، وأعاد تقليل ITPKB إنتاج ROS المستحث بواسطة TMZ والاستماتة، مما يشير إلى أن ITPKB يتوسط مقاومة TMZ من خلال تنظيم توازن ROS.
حددت الدراسة أيضًا Trim25 كشريك ارتباط لـ ITPKB، الذي يتوسط اليوبكويتين المرتبط بـ K48 لـ ITPKB، مما يؤدي إلى تحلله وتقليل استقراره. تم تقليل التفاعل بين Trim25 وITPKB بعد علاج TMZ، مما يشير إلى آلية ما بعد النسخ للزيادة الملحوظة في مستويات بروتين ITPKB في الخلايا المقاومة. بالإضافة إلى ذلك، أظهر حالة الفسفرة لـ Trim25 عند موقع S100 تأثيرها على نشاط E3 ليغاس، مما يؤثر على استقرار ITPKB وبالتالي الاستجابة الخلوية لـ TMZ. بشكل عام، توضح هذه النتائج آلية جديدة تساهم من خلالها ITPKB في مقاومة TMZ في GBM من خلال تنظيم ROS وتبرز إمكانية استهداف محور ITPKB-Trim25 للتدخل العلاجي.
DOI: https://doi.org/10.1038/s41392-024-01763-x
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38438346
Publication Date: 2024-03-04
Author(s): Yuanliang Yan et al.
Primary Topic: interferon and immune responses
Overview
This research investigates the mechanisms of temozolomide (TMZ) resistance in glioblastoma (GBM), a prevalent and aggressive brain tumor. Despite TMZ being a standard treatment, the emergence of drug resistance poses significant challenges. The study utilized mass spectrometry to analyze the proteomic profiles of six pairs of GBM patients, identifying 648 proteins with significant differential expression between primary and recurrent tumors. Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) highlighted alterations in lipid metabolism and biological oxidations pathways, with a notable upregulation of inositol 1,4,5-trisphosphate kinase B (ITPKB) in recurrent tumors, which correlated with poor patient survival.
Further investigations revealed that depleting ITPKB in TMZ-resistant cells increased reactive oxygen species (ROS) linked to NADPH oxidase (NOX) activity, thereby restoring sensitivity to TMZ. The study elucidated that reduced phosphorylation of the E3 ligase Trim25 at the S100 position in recurrent GBM samples led to decreased ITPKB ubiquitination, enhancing its stability and impairing ROS production. Additionally, both ITPKB depletion and the ITPKB inhibitor GNF362 effectively countered TMZ chemoresistance in glioma xenograft models. These findings suggest a novel mechanism of TMZ resistance and position ITPKB as a potential therapeutic target for overcoming resistance in GBM treatment.
Introduction
The introduction of the research paper highlights the challenges associated with glioblastoma (GBM), the most aggressive subtype of glioma and the most common primary malignant tumor of the central nervous system. Despite the standard treatment combining radiotherapy and the DNA alkylating agent temozolomide (TMZ), which has shown a modest increase in survival rates, the prognosis remains poor due to the blood-brain barrier and high recurrence rates. Nearly 90% of GBM patients experience recurrence, and there are currently no effective treatments for recurrent cases, underscoring the urgent need for a deeper understanding of GBM’s molecular pathology and the identification of novel therapeutic targets.
The role of reactive oxygen species (ROS) in GBM is complex, as they can promote or suppress tumor growth. TMZ’s cytotoxic effects are linked to increased ROS levels, and resistance to TMZ is associated with oxidative stress insensitivity. The paper discusses the potential of polyphyllin VII and Sirtuin 1 inhibition to enhance TMZ sensitivity by modulating ROS levels. Furthermore, it introduces inositol-1,4,5-triphosphate (IP3) kinase B (ITPKB) as a novel target for TMZ resistance, with its upregulation correlating with poor patient outcomes. The study suggests that ITPKB’s regulation through ubiquitination by the E3 ligase Trim25 may play a critical role in GBM pathogenesis and treatment response, indicating that targeting ITPKB could improve therapeutic efficacy against GBM.
Methods
In this study, various glioblastoma (GBM) cell lines, including HEK293T, T98G, U118, and U87, were cultured and characterized using short tandem repeat genotyping. TMZ-resistant variants (T98G-R, U118-R, U87-R) were developed through stepwise selection with increasing concentrations of temozolomide (TMZ). Additionally, radiation-sensitive (U251) and resistant (U251-IR) GBM cells were utilized to explore the role of specific target genes in radioresistance. The cells were maintained in Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and 1% penicillin/streptomycin.
To investigate the function of ITPKB, knockdown cell lines were generated using lentiviral vectors containing specific shRNA sequences. Various plasmids encoding flag-tagged ITPKB mutants and V5-tagged Trim25 were obtained from commercial sources, and site-directed mutagenesis was employed to create point mutations and truncations, which were confirmed via Sanger sequencing. A range of antibodies targeting ITPKB, Trim25, and other proteins involved in cellular processes were utilized for subsequent analyses, alongside specific inhibitors to assess their effects on cellular responses. Viral infections were performed using Lipofectamine™ 3000 for transfection, followed by selection with puromycin to establish pure cell populations for further experimentation.
Results
The results of this study highlight the association of inositol-trisphosphate 3-kinase B (ITPKB) with glioma malignancy and resistance to temozolomide (TMZ) treatment in glioblastoma (GBM). A proteomic analysis of six pairs of GBM patients revealed significant differences in protein expression between primary and recurrent tumors, identifying 266 upregulated and 382 downregulated proteins. Notably, pathways related to biological oxidations and lipid metabolism were enriched in recurrent tumors. Among the identified kinases, ITPKB and ITPK1 were consistently upregulated in recurrent samples, with ITPKB showing a strong correlation with poorer survival outcomes in GBM patients.
Further investigations demonstrated that ITPKB expression was significantly higher in TMZ-resistant GBM cell lines compared to sensitive ones. While ITPKB levels did not differ between radiation-sensitive and resistant cells, its expression was induced in sensitive cells upon TMZ treatment, a response absent in resistant cells. Knockdown of ITPKB in TMZ-resistant lines increased drug sensitivity, and reexpression of wild-type ITPKB restored survival inhibition, indicating its role in resistance mechanisms. Additionally, the selective ITPKB inhibitor GNF362, when combined with TMZ, significantly reduced cell survival in resistant lines. These findings underscore the critical role of ITPKB in mediating TMZ resistance in GBM, suggesting it as a potential therapeutic target.
Discussion
In this study, the authors investigated the role of inositol 1,4,5-trisphosphate 3-kinase B (ITPKB) in conferring resistance to temozolomide (TMZ) in glioblastoma multiforme (GBM) patients. Tissue specimens from six pairs of primary and recurrent GBM were analyzed using TMT-labeling HPLC-MS/MS proteome analysis, revealing significant differential protein expression associated with TMZ resistance. Immunohistochemical staining of 19 additional GBM specimens confirmed the presence of ITPKB, which was found to correlate positively with ROS-related signaling pathways. Notably, TMZ-resistant cells exhibited elevated basal ROS levels, and knocking down ITPKB restored TMZ-induced ROS production and apoptosis, indicating that ITPKB mediates TMZ resistance through the regulation of ROS homeostasis.
The study further identified Trim25 as a binding partner of ITPKB, which mediates K48-linked ubiquitination of ITPKB, leading to its degradation and reduced stability. The interaction between Trim25 and ITPKB was diminished following TMZ treatment, suggesting a posttranscriptional mechanism for the observed increase in ITPKB protein levels in resistant cells. Additionally, the phosphorylation state of Trim25 at the S100 site was shown to influence its E3 ligase activity, affecting ITPKB stability and, consequently, the cellular response to TMZ. Overall, these findings elucidate a novel mechanism by which ITPKB contributes to TMZ resistance in GBM through ROS regulation and highlight the potential of targeting the ITPKB-Trim25 axis for therapeutic intervention.