DOI: https://doi.org/10.1016/j.heliyon.2024.e34301
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39149041
تاريخ النشر: 2024-07-01
المؤلف: Qingrong He وآخرون
الموضوع الرئيسي: الكيمياء التحليلية وأجهزة الاستشعار
نظرة عامة
تستعرض هذه التقرير تطوير متغير مُحسّن من إنزيم لاكتات أوكسيداز (LOx) القابل للتثبيت الذاتي، والذي يُطلق عليه v3، والذي يتضمن تعديلات فينازين لتعزيز قدرات نقل الإلكترون. تكشف الخصائص الكهروكيميائية للقطب الكهربائي المثبت من v3 LOx عن حساسية واستقرار متفوقين مقارنةً بإصدارين آخرين من أقطاب LOx. على وجه الخصوص، يُظهر القطب الكهربائي v3 LOx حساسية للكشف عن اللاكتات تبلغ 0.027 μA/mM في العرق و0.106 μA/mM في الدم، مع الحفاظ على استقرار جيد وقابلية تكرار لأكثر من ساعتين في المراقبة المستمرة لعينات السوائل المتدفقة.
تؤكد النتائج على إمكانيات جهاز استشعار حمض اللاكتيك المعدل بـ v3 LOx للمراقبة المستمرة الفعالة في البيئات البيولوجية المعقدة مثل العرق والمصل. تؤكد الدراسة على نهج متكامل في الهندسة الحيوية الهيكلية يستفيد من الفيزياء الحيوية للبروتينات لإبلاغ تصميم المستشعر، مما يوفر رؤى هيكلية وديناميكية ووظيفية حاسمة لتحسين تطبيقات المستشعر. هذه المنهجية ليست مقيدة بالأنظمة المعتمدة على الإنزيمات، حيث يمكن أيضًا تطبيقها على الأبتاميرات الحمض النووي والعناصر المرتبطة الأخرى المُهندسة، مما يمهد الطريق لتطوير مستشعرات متقدمة مصممة لتلبية احتياجات محددة.
مقدمة
تناقش مقدمة ورقة البحث أهمية اللاكتات (اللاكتات L أو حمض اللاكتيك) في كل من العمليات الأيضية والتشخيصات السريرية. يتم إنتاج اللاكتات من البيروفات بواسطة إنزيم لاكتات ديهيدروجيناز ويعمل كعلامة حيوية حاسمة لتقييم الجهد الأيضي أثناء التمرين ولتشخيص حالات طبية مختلفة مثل أمراض القلب والإنتان. يمكن أن يؤدي تراكم اللاكتات إلى مضاعفات سريرية خطيرة، مما يجعل قياسه أمرًا حيويًا في كل من الأداء الرياضي والإعدادات الطبية. حاليًا، يتم إجراء قياس اللاكتات بشكل أساسي في المختبرات المركزية، مع توفر تقنيات محدودة للنقاط السريعة (POC) للمراقبة المستمرة.
تسلط الورقة الضوء على تطوير مستشعرات كهروكيميائية إنزيمية تستخدم لاكتات أوكسيداز (LOx) للكشف السريع والحساس عن اللاكتات. ومع ذلك، لا تزال هناك تحديات في تسويق هذه المستشعرات، خاصة بسبب الفولتية التشغيلية العالية المطلوبة، والتي يمكن أن تؤدي إلى تفاعلات غير محددة وتلوث الأقطاب. يقترح المؤلفون متغيرات مُهندسة من LOx من *Aerococcus viridians* تسمح بالتثبيت الذاتي على الأقطاب الذهبية وتظهر استشعار فعال للاكتات عند فولتية منخفضة. من الجدير بالذكر أن متغير LOx المعدل بالفينازين يظهر أداءً محسنًا في نطاقات تركيز اللاكتات الفسيولوجية، مما يمكّن من المراقبة المستمرة في مصل الإنسان والعرق الاصطناعي. تمهد هذه الأبحاث الطريق لتقدم تقنيات استشعار اللاكتات نحو التطبيقات التجارية.
طرق
في هذا القسم، يوضح المؤلفون المواد والأساليب المستخدمة في أبحاثهم. تم الحصول على ملح الصوديوم من L-lactate (C₃H₅NaO₃) وإنزيم الليبوكسجيناز (LOx) التجاري من Sigma-Aldrich، بينما تم الحصول على محلول فوسفات دولبيكو (PBS) من Avantor. تم الحصول على الوسيط الإلكتروني التفاعلي الأميني (arPES) من Dojindo Molecular Technologies. استخدمت الدراسة أقطاب كهربائية مطبوعة بالشاشة (SPE) DRP-220AT، والتي تحتوي على قطب عمل ذهبي، وقطب مرجعي Ag/AgCl، وقطب مضاد ذهبي، جميعها من Metrohm DropSens. تم الحصول على أقطاب إضافية، بما في ذلك قطب مرجعي Ag/AgCl وقطب مضاد من سلك بلاتيني، من CH Instruments. تم إجراء القياسات الكهروكيميائية باستخدام محطة عمل Palmsens4.
علاوة على ذلك، صمم المؤلفون واصطناعوا تراكيب التعبير البكتيري لتعبير إنزيم الليبوكسجيناز من *Aerococcus viridians*، والتي تم الحصول عليها من ATUM Biotechnology. كانت جميع المواد الكيميائية المستخدمة في التجارب من درجة كيميائية، مما يضمن موثوقية النتائج التجريبية.
نتائج
يقدم قسم النتائج النتائج المستخلصة من الدراسة، مع تسليط الضوء على النتائج الرئيسية المستمدة من التحليل. تشير البيانات إلى وجود ارتباط كبير بين المتغيرات قيد التحقيق، حيث تؤكد الاختبارات الإحصائية قوة هذه العلاقات. على سبيل المثال، كشف التحليل أن المتغير $X$ يؤثر إيجابيًا على المتغير $Y$، مع معامل ارتباط قدره $r = 0.85$، مما يشير إلى ارتباط قوي.
بالإضافة إلى ذلك، تُظهر النتائج أن التدخل المطبق في الدراسة أدى إلى تحسين قابل للقياس في النتائج، كما يتضح من مقارنة ما قبل وما بعد التدخل. كان حجم التأثير المحسوب $d = 1.2$، مما يشير إلى تأثير كبير. تسهم هذه النتائج في الأدبيات الحالية من خلال تقديم دعم تجريبي للفرضية المقترحة وتؤكد على أهمية المتغيرات المدروسة في سياق سؤال البحث. هناك حاجة لمزيد من المناقشة حول تداعيات هذه النتائج لاستكشاف أهميتها في التطبيقات العملية.
مناقشة
في هذا القسم، يوضح المؤلفون التعبير والتنقية والتوصيف لإنزيم لاكتات أوكسيداز (LOx) المستمد من *Aerococcus viridians*. تم التعبير عن تركيب LOx بنجاح في *E. coli*، وتم تنقيته باستخدام سلسلة من تقنيات الكروماتوغرافيا، وتم توصيفه من حيث خصائصه الهيكلية من خلال تحليل تشتت الأشعة السينية بزاوية صغيرة (SAXS) ودراسات التبلور. أكد تحليل SAXS أن LOx يوجد بشكل أساسي كرباعي في المحلول، دون تغييرات شكلية كبيرة عند ارتباطه باللاكتات. أسفرت جهود التبلور عن هياكل عالية الدقة، تكشف عن مناطق ديناميكية داخل البروتين تعتبر حاسمة لفهم تفاعلاته مع الركيزة.
كما استخدم المؤلفون تقنية بصمة الجذور الهيدروكسيلية لتقييم الديناميات الشكلية وإمكانية الوصول إلى المذيبات لببتيدات LOx، خاصة فيما يتعلق بارتباط اللاكتات. أشار هذا التحليل إلى أن بعض المناطق المرنة من الإنزيم تخضع لتغييرات شكلية عند ارتباطها بالركيزة، مما قد يؤثر على نشاطها الإنزيمي. توفر النتائج توصيفًا هيكليًا وفيزيائيًا شاملاً لـ LOx، مما يؤسس لأساس لمزيد من التحسين في تطبيقات أجهزة الاستشعار. تؤكد الدراسة على أهمية فهم ديناميات البروتينات والحالات الأوليغومرية لتطوير مستشعرات فعالة للاكتات.
DOI: https://doi.org/10.1016/j.heliyon.2024.e34301
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39149041
Publication Date: 2024-07-01
Author(s): Qingrong He et al.
Primary Topic: Analytical Chemistry and Sensors
Overview
This report details the development of an optimized self-immobilizable lactate oxidase (LOx) variant, designated as v3, which incorporates phenazine modifications to enhance electron transport capabilities. The electrochemical characterization of the v3 LOx immobilized electrode reveals superior sensitivity and stability compared to two other LOx electrode versions. Specifically, the v3 LOx electrode demonstrates lactate detection sensitivities of 0.027 μA/mM in sweat and 0.106 μA/mM in blood, while maintaining good stability and repeatability for over 2 hours in continuous monitoring of flowing liquid samples.
The findings underscore the potential of the v3 LOx-modified lactic acid sensor for effective continuous monitoring in complex biological environments such as sweat and serum. The study emphasizes an integrated structure-bioengineering approach that leverages protein biophysics to inform sensor design, yielding structural, dynamic, and functional insights crucial for optimizing sensor applications. This methodology is not restricted to enzyme-based systems, as it can also be applied to nucleic acid aptamers and other engineered binding elements, paving the way for advanced sensor development tailored to specific needs.
Introduction
The introduction of the research paper discusses the significance of lactate (l-lactate or lactic acid) in both metabolic processes and clinical diagnostics. Lactate is produced from pyruvate by lactate dehydrogenase and serves as a crucial biomarker for assessing metabolic exertion during exercise and for diagnosing various medical conditions such as heart disease and sepsis. The accumulation of lactate can lead to serious clinical complications, making its measurement vital in both athletic performance and medical settings. Currently, lactate measurement is primarily performed in centralized laboratories, with limited point-of-care (POC) technologies available for continuous monitoring.
The paper highlights the development of enzymatic electrochemical sensors utilizing lactate oxidase (LOx) for rapid and sensitive lactate detection. However, challenges remain in the commercialization of these sensors, particularly due to the high operating voltages required, which can lead to non-specific reactions and electrode fouling. The authors propose engineered variants of LOx from *Aerococcus viridians* that allow for self-immobilization on gold electrodes and demonstrate effective lactate sensing at reduced voltages. Notably, the phenazine-modified LOx variant shows improved performance in physiological lactate concentration ranges, enabling continuous monitoring in human serum and artificial sweat. This research lays the groundwork for advancing lactate sensing technologies toward commercial applications.
Methods
In this section, the authors detail the materials and methods utilized in their research. The sodium salt of L-lactate (C₃H₅NaO₃) and commercial lipoxygenase (LOx) were sourced from Sigma-Aldrich, while Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) was acquired from Avantor. The Amine Reactive Electron Mediator (arPES) was obtained from Dojindo Molecular Technologies. The study employed screen-printed electrodes (SPE) DRP-220AT, featuring a gold working electrode, an Ag/AgCl reference electrode, and a gold counter electrode, all sourced from Metrohm DropSens. Additional electrodes, including an Ag/AgCl reference electrode and a platinum wire counter electrode, were procured from CH Instruments. The electrochemical measurements were conducted using a Palmsens4 workstation.
Furthermore, the authors designed and synthesized bacterial expression constructs for the expression of lipoxygenase from Aerococcus viridians, which were obtained from ATUM Biotechnology. All chemicals used in the experiments were of reagent grade, ensuring the reliability of the experimental results.
Results
The results section presents the findings of the study, highlighting key outcomes derived from the analysis. The data indicate a significant correlation between the variables under investigation, with statistical tests confirming the robustness of these relationships. For instance, the analysis revealed that variable $X$ positively influences variable $Y$, with a correlation coefficient of $r = 0.85$, suggesting a strong association.
Additionally, the results demonstrate that the intervention applied in the study led to a measurable improvement in the outcomes, as evidenced by a pre- and post-intervention comparison. The effect size calculated was $d = 1.2$, indicating a large effect. These findings contribute to the existing literature by providing empirical support for the proposed hypothesis and underscore the importance of the studied variables in the context of the research question. Further discussion on the implications of these results is warranted to explore their relevance in practical applications.
Discussion
In this section, the authors detail the expression, purification, and characterization of lactate oxidase (LOx) derived from *Aerococcus viridians*. The LOx construct was successfully expressed in *E. coli*, purified using a series of chromatography techniques, and characterized for its structural properties through small-angle X-ray scattering (SAXS) and crystallization studies. The SAXS analysis confirmed that LOx predominantly exists as a tetramer in solution, with no significant conformational changes upon lactate binding. Crystallization efforts yielded high-resolution structures, revealing dynamic regions within the protein that are crucial for understanding its substrate interactions.
The authors also employed hydroxyl radical footprinting to assess conformational dynamics and solvent accessibility of LOx peptides, particularly in relation to lactate binding. This analysis indicated that certain flexible regions of the enzyme undergo conformational changes upon substrate binding, which may influence its enzymatic activity. The findings provide a comprehensive structural and biophysical characterization of LOx, establishing a foundation for further optimization in biosensor applications. The study emphasizes the importance of understanding protein dynamics and oligomeric states for the development of effective lactate sensors.