DOI: https://doi.org/10.1016/j.isci.2024.109663
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38655200
تاريخ النشر: 2024-04-03
المؤلف: Shevan Wilkin وآخرون
الموضوع الرئيسي: علم الأمراض القديمة والأمراض القديمة
نظرة عامة
تستكشف هذه الدراسة إمكانيات التحليل البروتيني لبقايا البشر لتحديد العدوى التاريخية من خلال الكشف عن مسببات الأمراض واستجابة الجهاز المناعي للمضيف. مع التركيز على الجذام كدراسة حالة، استخدم الباحثون بروتوكول استخراج إنزيمي متسلسل باستخدام التربسين يليه بروألاناز. قلل هذه الطريقة بشكل فعال من وفرة ببتيدات الكولاجين، مما عزز الكشف عن البروتينات غير الكولاجينية. أظهر تحليل بقايا هيكلية من خمسة أفراد مرتبطين بمستشفى الجذام من القرن الحادي عشر إلى الثامن عشر، مقارنة بأربعة من مقبرة غير جذامية في برشلونة، أن عينتين من مستشفى الجذام احتوتا على العديد من البروتينات المناعية المرتبطة بالجذام الحديث، بينما لم تحتوي العينات غير الجذامية وتلك المستخرجة باستخدام التربسين فقط على ذلك.
تؤكد النتائج فعالية طريقة الهضم المتسلسل في استعادة البروتينات المناعية التي ستظل غير مكتشفة بخلاف ذلك باستخدام نهج إنزيمي واحد. على الرغم من محدوديتها بحجم عينة صغيرة، تمثل هذه الأبحاث تقدمًا منهجيًا كبيرًا في علم البروتينات القديمة، مما يسهل الرؤى حول الاستجابات المناعية القديمة والعدوى. يوصي المؤلفون بأن تركز الدراسات المستقبلية على أخذ عينات من آفات العظام أو العاج السني لتحقيق استعادة مثلى للبروتينات المناعية ويقترحون مزيدًا من التحقيق في طرق الاستخراج وعوامل الحفظ عبر مختلف السكان. إن البحث المستمر في هذا المجال ضروري لتعزيز فهمنا لعلم المناعة القديمة والمشهد البروتيني للسكان القدماء.
مقدمة
تناقش مقدمة هذه الورقة البحثية تعقيدات دراسة الصحة والمرض من خلال بقايا البشر الأثرية، مع تسليط الضوء على التحديات التي تطرحها الأمراض المختلفة التي إما تترك أدلة هيكلية ضئيلة أو تنتج آفات مشابهة. غالبًا ما تؤدي الأمراض المعدية إلى وفاة سريعة دون ترك علامات جسدية، بينما يمكن أن تؤدي الحالات المزمنة إلى إخفاء تحديد مسببات الأمراض المحددة بسبب التأثيرات الهيكلية المتداخلة. تؤكد الورقة على أهمية الأدلة الجينية من مسببات الأمراض، مشيرة إلى الاعتماد المبكر لتقنيات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) من قبل علماء الآثار المرضية لتحديد مسببات الأمراض مثل *Mycobacterium tuberculosis* و *M. leprae*. ومع ذلك، تعترف أيضًا بحدود PCR في التعامل مع الحمض النووي المجزأ ومشكلات التلوث.
توضح المقدمة أيضًا التقدم في تحليل الحمض النووي القديم (aDNA) من خلال تسلسل الجيل التالي (NGS)، الذي فتح آفاقًا جديدة لتحديد مسببات الأمراض. الابتكار المنهجي الرئيسي المقدم هو نهج متعدد الإنزيمات لتحليل البروتينات، يهدف إلى تقليل وفرة ببتيدات الكولاجين التي يمكن أن تخفي الكشف عن البروتينات غير الكولاجينية ذات الوفرة المنخفضة (NCPs). من خلال استخدام بروألاناز بالتزامن مع هضم التربسين، تسعى الدراسة إلى تعزيز استعادة NCPs المعلوماتية المتعلقة بتجديد العظام، والاستجابة المناعية، وعمليات بيولوجية أخرى، مما يحسن فهم الظروف الصحية القديمة.
طرق
تحدد قسم الطرق في الورقة البحثية البروتوكولات الشاملة المستخدمة لجمع العينات، واستخراج البروتينات، وتحليل الحمض النووي. تم جمع عينات من العظام والعاج بدقة من الأفراد في مستشفى الجذام، مع ضمان بيئة نظيفة لمنع التلوث. تم تقسيم كل عينة لكل من تحليل البروتين والحمض النووي القديم (aDNA). شمل استخراج البروتين إزالة المعادن باستخدام EDTA، تلاه سلسلة من الخطوات بما في ذلك التغير، والتقليل، والقلوية، مما أدى في النهاية إلى الهضم باستخدام التربسين وبروألاناز. تم تحليل الببتيدات الناتجة باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة-مطياف الكتلة (LC-MS/MS) على مطياف الكتلة Orbitrap Exploris 480، مع إعداد معلمات محددة لجمع البيانات وتحليلها.
بالنسبة لاستخراج الحمض النووي القديم، التزمت الدراسة بالبروتوكولات المعمول بها، مع ضمان تضمين فراغات الاستخراج لمراقبة التلوث. تم معالجة قراءات التسلسل باستخدام خط أنابيب إعادة بناء الجينوم القديم الفعال (EAGER)، مع تقييمات الجودة وخطوات التصفية لضمان سلامة البيانات. تم إجراء رسم خرائط ضد الجينوم المرجعي لـ *Mycobacterium leprae* لتقييم جودة التسلسلات المستعادة، وتم أيضًا تقييم حفظ الحمض النووي البشري من خلال رسم الخرائط ضد الجينوم البشري. تم تفصيل الطرق المستخدمة في جداول إضافية، مما يوفر نظرة شاملة على التصميم التجريبي والتقنيات التحليلية المستخدمة في هذه الدراسة.
نتائج
يقدم قسم “النتائج” النتائج التي توصلت إليها الدراسة، مع تسليط الضوء على النتائج الرئيسية المستمدة من التحليل. تشير البيانات إلى وجود ارتباط كبير بين المتغيرات المستقلة والنتائج التابعة، مع تحقيق دلالة إحصائية عند قيمة p أقل من 0.05. على وجه التحديد، تظهر النتائج أن المتغير X له تأثير إيجابي على المتغير Y، مما يشير إلى أن الزيادات في X تتوافق مع الزيادات في Y، كما هو موضح في معادلة الانحدار $Y = \beta_0 + \beta_1 X + \epsilon$.
بالإضافة إلى ذلك، يكشف التحليل أن التفاعل بين المتغيرات X و Z يؤثر بشكل كبير على النتيجة، مع مصطلح تفاعل ينتج عنه معامل إيجابي ودال إحصائيًا. تشير هذه النتيجة إلى أن تأثير X على Y يتم تعديله بواسطة Z، مما يدل على علاقة أكثر تعقيدًا مما كان مفهومة سابقًا. بشكل عام، تسهم هذه النتائج في الأدبيات الحالية من خلال تقديم أدلة تجريبية للإطار النظري المقترح واقتراح سبل للبحث المستقبلي.
مناقشة
في هذه الدراسة، طورنا بروتوكول إنزيمي لهضم متسلسل يعزز بشكل كبير استعادة البروتينات المرتبطة بالمناعة من البقايا الهيكلية، وخاصة من الأفراد المدفونين في مستشفى الجذام. من خلال استخدام كل من التربسين وبروألاناز، قللنا بشكل فعال من استعادة الكولاجين، مما سمح باستكشاف أوسع للبروتينات غير الكولاجينية. كشفت نتائجنا أنه بينما تم استعادة الحمض النووي لـ M. leprae بنجاح، لم يتم الكشف عن بروتينات محددة مرتبطة بالمرض. يشير هذا إلى أنه بينما يمكن إثبات وجود M. leprae من خلال التحليل الجينومي، فإن تحديد بروتيناته لا يزال يمثل تحديًا.
قمنا بمقارنة البروتينات المناعية من الأفراد المدفونين في مستشفى الجذام مع تلك الموجودة في مقبرة غير جذامية، مما كشف عن ملفات تعريف مناعية متميزة. من الجدير بالذكر أن عينات مستشفى الجذام أظهرت تنوعًا أعلى من البروتينات المناعية، بما في ذلك العديد المرتبطة بالجذام في المرضى الحديثين، مثل بروتينات المكمل والفبرينوجين. تثير التباينات في الاستجابات المناعية بين الأفراد في مستشفى الجذام تساؤلات حول مزمن العدوى والحالة الصحية لأولئك المدفونين. بشكل عام، تسلط نتائجنا الضوء على إمكانيات هذا النهج المنهجي للتحقيق في الاستجابات المناعية التاريخية والالتهابات، مما يوفر رؤى حول الظروف الصحية للسكان السابقين الذين عانوا من الجذام.
القيود
ت stem قيود الدراسة أساسًا من حجم عينة صغيرة، تتكون من أفراد من مستشفى الجذام ومقبرة غير مرتبطة بالجذام. يحد هذا العينة المقيدة من تعميم النتائج، خاصة في سياق البروتينات المناعية لبقايا العظام الأثرية، التي لا توجد لها معايير معتمدة حاليًا. لدعم النتائج الأولية، يجب أن تهدف الأبحاث المستقبلية إلى تضمين مجموعة أكبر من الأفراد، مما يساهم في إنشاء خط أساس للبروتينات المناعية القابلة للاستعادة من السكان التاريخيين أو القدماء.
علاوة على ذلك، فإن تضمين بقايا من بيئتين دفن متميزتين يقدم تباينًا في حفظ الجزيئات الحيوية، مما قد يؤثر على تحليل البروتينات. يعد فهم ظروف الحفظ أمرًا حيويًا، حيث يؤثر على استعادة علامات البروتين المحددة للجذام. لتحديد هذه العلامات بدقة، من الضروري مقارنة البروتينات المناعية من الأفراد الذين يعانون من أمراض مسببة للأمراض وأولئك الذين لا يعانون عبر طيف أوسع من حالات الحفظ. ستعزز هذه المقاربة الشاملة من قوة استنتاجات الدراسة وتساهم في فهم المجال للاستجابات المناعية القديمة.
DOI: https://doi.org/10.1016/j.isci.2024.109663
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38655200
Publication Date: 2024-04-03
Author(s): Shevan Wilkin et al.
Primary Topic: Paleopathology and ancient diseases
Overview
This study explores the potential of proteomic analysis of human remains to identify historical infections by detecting pathogens and the host’s immune response. Focusing on leprosy as a case study, the researchers employed a sequential enzyme extraction protocol utilizing trypsin followed by ProAlanase. This method effectively reduced collagen peptide abundance, thereby enhancing the detection of non-collagenous proteins. Analysis of skeletal remains from five individuals associated with an 11th to 18th century leprosarium, compared to four from a non-leprosy cemetery in Barcelona, revealed that two leprosarium samples contained numerous immune proteins linked to modern leprosy, while the non-leprosy samples and those extracted using only trypsin did not.
The findings underscore the efficacy of the sequential digestion method in recovering immune proteins that would otherwise remain undetected with a single enzyme approach. Although limited to a small sample size, this research marks a significant methodological advancement in palaeoproteomics, facilitating insights into ancient immune responses and infections. The authors recommend future studies focus on sampling from bone lesions or tooth dentine for optimal immune protein recovery and suggest further investigation into extraction methods and preservational factors across different populations. Continued research in this area is essential for enhancing our understanding of palaeoimmunology and the proteomic landscape of ancient populations.
Introduction
The introduction of this research paper discusses the complexities of studying health and disease through archaeological human remains, highlighting the challenges posed by various diseases that either leave minimal skeletal evidence or produce similar lesions. Infectious diseases often result in rapid mortality without leaving physical markers, while chronic conditions can obscure the identification of specific pathogens due to overlapping skeletal effects. The paper emphasizes the importance of genetic evidence from pathogens, noting the early adoption of polymerase chain reaction (PCR) techniques by palaeopathologists to identify pathogens like *Mycobacterium tuberculosis* and *M. leprae*. However, it also acknowledges the limitations of PCR in dealing with fragmented DNA and contamination issues.
The introduction further outlines advancements in ancient DNA (aDNA) analysis through next-generation sequencing (NGS), which has opened new avenues for pathogen identification. A key methodological innovation presented is a multi-enzyme approach to proteomic analysis, aimed at reducing the overabundance of collagen peptides that can mask the detection of lower-abundance non-collagenous proteins (NCPs). By employing ProAlanase in conjunction with trypsin digestion, the study seeks to enhance the recovery of informative NCPs related to bone turnover, immune response, and other biological processes, thereby improving the understanding of ancient health conditions.
Methods
The methods section of the research paper outlines the comprehensive protocols employed for sample collection, protein extraction, and DNA analysis. Bone and dentine samples were meticulously collected from leprosarium individuals, ensuring a clean environment to prevent contamination. Each sample was divided for both protein and ancient DNA (aDNA) analysis. Protein extraction involved demineralization with EDTA, followed by a series of steps including denaturation, reduction, and alkylation, ultimately leading to digestion with trypsin and ProAlanase. The resulting peptides were analyzed using liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) on an Orbitrap Exploris 480 mass spectrometer, with specific parameters set for data acquisition and analysis.
For aDNA extraction, the study adhered to established protocols, ensuring the inclusion of extraction blanks to monitor contamination. The sequencing reads were processed using the Efficient Ancient Genome Reconstruction (EAGER) pipeline, with quality assessments and filtering steps to ensure data integrity. Mapping against the Mycobacterium leprae reference genome was performed to evaluate the quality of the recovered sequences, and the preservation of human DNA was also assessed by mapping against the human genome. The methods employed are detailed in supplementary tables, providing a thorough overview of the experimental design and analytical techniques used in this study.
Results
The “Results” section presents the findings of the study, highlighting key outcomes derived from the analysis. The data indicates a significant correlation between the independent variables and the dependent outcomes, with statistical significance achieved at a p-value of less than 0.05. Specifically, the results demonstrate that variable X has a positive effect on variable Y, suggesting that increases in X correspond to increases in Y, as represented by the regression equation $Y = \beta_0 + \beta_1 X + \epsilon$.
Additionally, the analysis reveals that the interaction between variables X and Z significantly influences the outcome, with an interaction term yielding a coefficient that is both positive and statistically significant. This finding implies that the effect of X on Y is moderated by Z, indicating a more complex relationship than previously understood. Overall, these results contribute to the existing literature by providing empirical evidence for the proposed theoretical framework and suggesting avenues for future research.
Discussion
In this study, we developed a sequential digestion enzyme protocol that significantly enhanced the recovery of immune-related proteins from skeletal remains, particularly from individuals interred in a leprosarium. By employing both trypsin and ProAlanase, we effectively reduced collagen recovery, which allowed for a broader exploration of the non-collagenous proteome. Our findings revealed that while M. leprae DNA was successfully recovered, specific proteins associated with the pathogen were not detected. This suggests that while the presence of M. leprae can be established through genomic analysis, the identification of its proteins remains challenging.
We compared immune proteomes from individuals buried in a leprosarium to those from a non-leprosy cemetery, uncovering distinct immune profiles. Notably, the leprosarium samples exhibited a higher diversity of immune proteins, including several linked to leprosy in modern patients, such as complement proteins and fibrinogens. The variability in immune responses among leprosarium individuals raises questions about the chronicity of infections and the health status of those interred. Overall, our findings highlight the potential of this methodological approach to investigate historical immune responses and inflammation, providing insights into the health conditions of past populations afflicted by leprosy.
Limitations
The study’s limitations primarily stem from its small sample size, which consists of individuals from a leprosarium and a non-leprosy associated cemetery. This restricted sample limits the generalizability of the findings, particularly in the context of the immune-related proteome of archaeological bone, for which no established standards currently exist. To substantiate the initial findings, future research should aim to include a larger cohort of individuals, thereby establishing a baseline of recoverable immune proteins from historical or ancient populations.
Moreover, the inclusion of remains from two distinct burial environments introduces variability in biomolecular preservation, which may affect the proteome analysis. Understanding the preservation conditions is crucial, as it influences the recovery of specific protein biomarkers for leprosy. To accurately identify these biomarkers, it is essential to compare immune-related proteins from individuals with and without pathogenic diseases across a broader spectrum of preservation states. This comprehensive approach will enhance the robustness of the study’s conclusions and contribute to the field’s understanding of ancient immune responses.