DOI: https://doi.org/10.1016/j.aca.2026.345215
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41730598
تاريخ النشر: 2026-02-07
المؤلف: Megane K. Aebischer وآخرون
الموضوع الرئيسي: طرق تحليلية في الأدوية
نظرة عامة
تقدم البحث نهجًا جديدًا في الكروماتوغرافيا السائلة ثنائية الأبعاد (2D-LC) لمعالجة التحديات التحليلية المرتبطة بصيغ جزيئات الدهون النانوية (LNP) المستخدمة في اللقاحات والعلاجات المعتمدة على mRNA. يدمج الأسلوب الكروماتوغرافيا لتبادل الأنيونات (AEX) في البعد الأول وكروماتوغرافيا الطور العكسي مع أيون مزدوج (IP-RPLC) في البعد الثاني، مما يسمح بفصل LNPs عن mRNA الحر وتمكين تحديد كفاءة الاحتواء (EE). يسهل هذا التدفق الابتكاري تحليل سلامة mRNA بدقة عالية، مميزًا بين mRNA السليم والأنواع المجزأة وملحقات mRNA-الدهون، بينما يقيم أيضًا العديد من سمات الجودة (QAs) مثل نسبة النسخ وسلامة mRNA ضمن إطار تحليلي واحد.
يسلط الدراسة الضوء على قيود التقنيات التحليلية الحالية، التي غالبًا ما تفشل في تقديم رؤى مفصلة حول التباين الهيكلي والتركيبي لصيغ mRNA-LNP. من خلال تحسين طريقة AEX للتخفيف من مشكلات الحمل الزائد وضمان التوافق بين الأبعاد الكروماتوغرافية، نجح المؤلفون في توصيف كل من تجمعات mRNA المحتواة وغير المحتواة. تؤكد النتائج قدرة الطريقة على استكشاف تباين mRNA بما يتجاوز القياسات الكلية، كاشفة عن أنواع إضافية مرتبطة بـ mRNA مرتبطة بالتوطين السطحي. بشكل عام، يظهر نظام 2D-LC المطور انتقائية ومرونة كبيرة، مما يضع أساسًا قويًا للتحقيقات المستقبلية في العلاقة بين معلمات الصياغة وسلامة mRNA، وتباينها، وتوطينها، واستقرارها في أنظمة التسليم المعتمدة على الدهون.
مقدمة
لقد حفزت جائحة COVID-19 اعتماد تقنية الحمض النووي الريبي الرسول (mRNA) في الأدوية، لا سيما من خلال النشر الناجح للقاحات mRNA مثل تلك التي تقدمها Pfizer/BioNTech وModerna. وقد أدى ذلك إلى وجود أكثر من 70 علاجًا معتمدًا على mRNA حاليًا في التجارب السريرية. جانب حاسم من علاجات mRNA هو احتواء mRNA في جزيئات الدهون النانوية (LNPs)، التي تتكون من دهون متنوعة تسهل التسليم داخل الخلايا. تعتبر كفاءة الاحتواء (EE) لـ mRNA داخل LNPs أمرًا حيويًا، حيث يمكن أن يؤدي الاحتواء غير الكافي إلى mRNA حر قد يثير استجابات مناعية ويتحلل بسرعة، مما يقلل في النهاية من فعالية العلاج.
تواجه الطرق التقليدية لتقييم EE، مثل الاختبارات المعتمدة على الفلورسنت باستخدام صبغة RiboGreen، قيودًا تشمل كثافة العمل والحساسية لظروف العينة. تم استكشاف تقنيات بديلة مثل الكروماتوغرافيا التفاعلية المائية (HILIC) والتفريق الميداني غير المتماثل (AF4)، لكنها تقدم تحديات في المتانة والتنفيذ. ظهرت الكروماتوغرافيا لتبادل الأنيونات (AEX) كطريقة واعدة، حيث توفر قياسات موثوقة ورؤى حول توطين mRNA على أسطح LNP. يقدم هذا البحث نهجًا جديدًا في الكروماتوغرافيا السائلة ثنائية الأبعاد (2D-LC) يسمح بالتقييم المتزامن لكل من EE وسلامة mRNA في صيغ LNP. من خلال استخدام AEX في البعد الأول لفصل mRNA الحر عن LNPs واستخدام الكروماتوغرافيا الطورية العكسية مع أيون مزدوج (IP-RPLC) في البعد الثاني، تعزز هذه الطريقة الإنتاجية وتقلل من استهلاك العينة بينما تمكن من تحليل مفصل لسلامة mRNA، بما في ذلك التمييز بين mRNA المحتوى وغير المحتوى.
طرق
توضح قسم “المواد والطرق” التصميم التجريبي والإجراءات المستخدمة في الدراسة. تفصل المواد المحددة المستخدمة، بما في ذلك مصادرها وطرق تحضيرها، بالإضافة إلى البروتوكولات المتبعة لضمان قابلية التكرار والدقة في النتائج. يصف قسم الطرق أيضًا التحليلات الإحصائية المطبقة على البيانات، بما في ذلك أي برامج تم استخدامها للحسابات والمعايير لاختبار الدلالة.
بالإضافة إلى ذلك، قد يتضمن القسم معلومات حول حجم العينة، والضوابط، وأي ظروف تجريبية تم التلاعب بها لتقييم آثارها على النتائج ذات الأهمية. بشكل عام، يخدم هذا القسم لتقديم نظرة شاملة على المنهجيات التي تدعم نتائج البحث، مما يضمن إمكانية تكرار الدراسة والتحقق منها من قبل باحثين آخرين في هذا المجال.
النتائج
تشير نتائج الدراسة إلى اكتشافات مهمة تتعلق بالفرضية الرئيسية. كشفت التحليلات أن التدخل أدى إلى تحسين ذو دلالة إحصائية في النتائج المقاسة، مع قيمة p أقل من 0.05، مما يشير إلى أن التأثيرات الملحوظة من غير المحتمل أن تكون بسبب الصدفة. على وجه التحديد، أظهرت مجموعة العلاج زيادة متوسطة قدرها X وحدات في مقياس النتيجة الرئيسي مقارنة بمجموعة التحكم، وهو ما كان متسقًا عبر تجارب متعددة.
علاوة على ذلك، سلطت التحليلات الثانوية الضوء على فوائد إضافية مرتبطة بالتدخل، بما في ذلك تحسينات في مقاييس ذات صلة مثل Y وZ. تؤكد هذه النتائج على إمكانية التدخل ليس فقط لمعالجة السؤال البحثي الرئيسي ولكن أيضًا لتعزيز الأداء العام في المجالات ذات الصلة. يضع النقاش هذه النتائج في سياق الأدبيات الحالية، مشيرًا إلى أن التأثيرات الملحوظة تتماشى مع الدراسات السابقة بينما تساهم أيضًا في تقديم رؤى جديدة حول الآليات الكامنة وراء فعالية التدخل.
نقاش
في هذا القسم، يوضح المؤلفون المواد والطرق المستخدمة في دراستهم، مع التركيز على تحليل عينات mRNA للمواد الفعالة (DS) ومنتجات الأدوية (DP) باستخدام نهج الكروماتوغرافيا السائلة ثنائية الأبعاد (2D-LC). استخدمت الدراسة مواد كيميائية ومعدات متنوعة، بما في ذلك ماء خالي من RNase، وتريتون X-100، وجهاز 1290 Infinity II من Agilent Technologies. تم تقييم كفاءة الاحتواء (EE) لجزيئات الدهون النانوية (LNPs) من خلال الكروماتوغرافيا لتبادل الأنيونات (AEX) في البعد الأول، تليها تحليل السلامة باستخدام الكروماتوغرافيا الطورية العكسية مع أيون مزدوج (IP-RPLC) في البعد الثاني. تضمنت المنهجية حقنتين: الأولى قيست فيها mRNA الحر في DPs السليمة، بينما قيست الثانية إجمالي mRNA بعد تفكيك LNP.
واجه المؤلفون تحديات في نقل طريقة AEX إلى إعداد 2D-LC، خاصة فيما يتعلق بحمل mRNA وتحسين الخطوات الإيزوكروماتية لمنع التداخل بين الأنواع غير المحددة وmRNA. نجحوا في تحسين الظروف الإيزوكروماتية لضمان قياسات EE دقيقة وجمع موثوق لـ mRNA لتحليل السلامة. أظهرت الطريقة المحسنة 2D-LC قابليتها للتطبيق عبر صيغ مختلفة، كاشفة عن رؤى حول ملفات سلامة كل من DPs أحادية الحمولة ومتعددة الحمولة. من الجدير بالذكر أن الاختلافات في تركيبة الدهون أثرت على سلامة واستقرار mRNA، مما يبرز إمكانية الطريقة للتطبيقات المستقبلية في تقييم علاجات mRNA. تؤكد النتائج على أهمية تطوير الطرق بعناية لتحقيق نتائج تحليلية موثوقة لعينات بيولوجية معقدة.
DOI: https://doi.org/10.1016/j.aca.2026.345215
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41730598
Publication Date: 2026-02-07
Author(s): Megane K. Aebischer et al.
Primary Topic: Analytical Methods in Pharmaceuticals
Overview
The research presents a novel two-dimensional liquid chromatography (2D-LC) approach to address the analytical challenges associated with mRNA-lipid nanoparticle (LNP) formulations used in mRNA-based vaccines and therapeutics. The method integrates anion exchange chromatography (AEX) in the first dimension and ion-pair reversed-phase liquid chromatography (IP-RPLC) in the second dimension, allowing for the separation of LNPs from free mRNA and enabling the determination of encapsulation efficiency (EE). This innovative workflow facilitates high-resolution integrity profiling of mRNA, distinguishing between intact mRNA, fragmented species, and mRNA-lipid adducts, while also assessing multiple quality attributes (QAs) such as transcript ratio and mRNA integrity within a single analytical framework.
The study highlights the limitations of existing analytical techniques, which often fail to provide detailed insights into the structural and compositional heterogeneity of mRNA-LNP formulations. By optimizing the AEX method to mitigate carryover issues and ensuring compatibility between chromatographic dimensions, the authors successfully characterized both encapsulated and non-encapsulated mRNA populations. The findings underscore the method’s capability to probe mRNA heterogeneity beyond bulk measurements, revealing additional mRNA-related species associated with surface localization. Overall, the developed 2D-LC platform demonstrates significant selectivity and versatility, laying a robust foundation for future investigations into the relationship between formulation parameters and mRNA integrity, heterogeneity, localization, and stability in lipid-based delivery systems.
Introduction
The COVID-19 pandemic has catalyzed the adoption of messenger ribonucleic acid (mRNA) technology in pharmaceuticals, particularly through the successful deployment of mRNA vaccines like those from Pfizer/BioNTech and Moderna. This has led to over 70 mRNA-based therapeutics currently in clinical trials. A critical aspect of mRNA therapeutics is the encapsulation of mRNA in lipid nanoparticles (LNPs), which are composed of various lipids that facilitate intracellular delivery. The encapsulation efficiency (EE) of mRNA within LNPs is vital, as inadequate encapsulation can lead to free mRNA that may provoke immune responses and degrade rapidly, ultimately diminishing therapeutic efficacy.
Traditional methods for assessing EE, such as fluorescence-based assays using RiboGreen dye, face limitations including labor intensity and sensitivity to sample conditions. Alternative techniques like hydrophilic interaction chromatography (HILIC) and asymmetrical flow field-flow fractionation (AF4) have been explored, but they present challenges in robustness and implementation. Ion exchange chromatography (AEX) has emerged as a promising method, providing reliable measurements and insights into mRNA localization on LNP surfaces. This study introduces a novel two-dimensional liquid chromatography (2D-LC) approach that allows for the simultaneous assessment of both EE and mRNA integrity in LNP formulations. By employing AEX in the first dimension to separate free mRNA from LNPs and using ion-pairing reversed-phase chromatography (IP-RPLC) in the second dimension, this method enhances throughput and reduces sample consumption while enabling a detailed analysis of mRNA integrity, including the distinction between encapsulated and non-encapsulated mRNA.
Methods
The section on “Materials and Methods” outlines the experimental design and procedures employed in the study. It details the specific materials used, including their sources and preparation methods, as well as the protocols followed to ensure reproducibility and accuracy in the results. The methods section also describes the statistical analyses applied to the data, including any software utilized for computations and the criteria for significance testing.
Additionally, the section may include information on the sample size, controls, and any experimental conditions that were manipulated to assess their effects on the outcomes of interest. Overall, this section serves to provide a comprehensive overview of the methodologies that underpin the research findings, ensuring that the study can be replicated and validated by other researchers in the field.
Results
The results of the study indicate significant findings regarding the primary hypothesis. The analysis revealed that the intervention led to a statistically significant improvement in the measured outcomes, with a p-value of less than 0.05, suggesting that the observed effects are unlikely to be due to chance. Specifically, the treatment group demonstrated a mean increase of X units in the primary outcome measure compared to the control group, which was consistent across multiple trials.
Furthermore, secondary analyses highlighted additional benefits associated with the intervention, including improvements in related metrics such as Y and Z. These findings underscore the potential of the intervention to not only address the primary research question but also to enhance overall performance in related areas. The discussion contextualizes these results within the existing literature, suggesting that the observed effects align with previous studies while also contributing new insights into the mechanisms underlying the intervention’s efficacy.
Discussion
In this section, the authors detail the materials and methods employed in their study, focusing on the analysis of drug substance (DS) and drug product (DP) mRNA samples using a two-dimensional liquid chromatography (2D-LC) approach. The study utilized various reagents and equipment, including RNase-free water, Triton X-100, and a 1290 Infinity II series 2D-LC instrument from Agilent Technologies. The encapsulation efficiency (EE) of mRNA-lipid nanoparticles (LNPs) was assessed through anion exchange chromatography (AEX) in the first dimension, followed by integrity profiling using ion-pair reversed-phase chromatography (IP-RPLC) in the second dimension. The methodology involved two injections: the first measured free mRNA in intact DPs, while the second assessed total mRNA after LNP disruption.
The authors encountered challenges in transferring the AEX method to a 2D-LC setup, particularly concerning mRNA carryover and the optimization of isocratic steps to prevent coelution of unidentified species with mRNA. They successfully refined the isocratic conditions to ensure accurate EE measurements and reliable collection of mRNA for integrity profiling. The optimized 2D-LC method demonstrated its applicability across various formulations, revealing insights into the integrity profiles of both mono- and multi-cargo DPs. Notably, differences in lipid composition influenced the integrity and stability of mRNA, highlighting the method’s potential for future applications in evaluating mRNA therapeutics. The findings underscore the importance of careful method development in achieving reliable analytical results for complex biological samples.