DOI: https://doi.org/10.1242/jcs.264681
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41279060
تاريخ النشر: 2026-08-17
المؤلف: Goutham Kodakandla وآخرون
الموضوع الرئيسي: قنوات الأيونات والمستقبلات
نظرة عامة
تناقش هذه الفقرة آلية دخول الكالسيوم المعتمد على المتجر (SOCE)، الذي يتم تفعيله من خلال استنفاد الكالسيوم من مخازن الشبكة الإندوبلازمية (ER). تعمل البروتينات STIM1 و STIM2 كأجهزة استشعار للكالسيوم في الشبكة الإندوبلازمية، حيث تخضع لتغيرات شكلية تمكنها من التفاعل مع وتفعيل قنوات الكالسيوم Orai على الغشاء البلازمي. يظهر المؤلفون أن كل من Orai1 و STIM1 تخضعان لتعديل S-acylation الديناميكي بعد استنفاد المتجر، وهي عملية تعتمد على البروتين المحفز S-acyltransferase DHHC21.
تؤكد الدراسة على الدور الأساسي لـ DHHC21 في تسهيل SOCE سواء في المختبر أو في الجسم الحي. باستخدام نموذج فأر مُزال الشعر الذي يعبر عن DHHC21 ولكنه يفتقر إلى تفعيله بواسطة الكالسيوم، يكشف المؤلفون أن تفعيل DHHC21 ضروري لتعديل S-acylation لـ STIM1 والدخول اللاحق للكالسيوم. بالإضافة إلى ذلك، يلاحظون أن DHHC21 يتم تجنيده إلى مجمعات Orai1/STIM1 عند استنفاد المتجر، حيث يرتبط جسديًا بـ STIM1. تشير النتائج إلى أن الفئران المُزالة الشعر تظهر أعراضًا تشبه متلازمة تضخم الغدد اللمفاوية الذاتية المناعية (ALPS)، بما في ذلك ضعف إطلاق الكالسيوم المعتمد على Fas وزيادة مستويات فيتامين B12 في المصل. تسلط النتائج الضوء على الدور المهم لتعديل S-acylation الديناميكي في إشارات الرسول الثاني ووظيفة المناعة، مما يشير إلى أن استهداف DHHC21 قد يوفر طرقًا علاجية لـ ALPS والاضطرابات ذات الصلة التي تتميز بتنظيم غير طبيعي لتفعيل STIM1.
مقدمة
تناقش المقدمة الدور الحاسم لمستويات الكالسيوم داخل الخلايا في تنظيم وظائف فسيولوجية متنوعة، وخاصة من خلال آلية دخول الكالسيوم المعتمد على المتجر (SOCE). يتم بدء هذه العملية من خلال استنفاد مخازن الكالسيوم في الشبكة الإندوبلازمية (ER)، مما ينشط جهاز استشعار الكالسيوم جزيء التفاعل السيتوبلازمي 1 (STIM1)، الذي يتفاعل بعد ذلك مع قناة الكالسيوم Orai1 لتشكيل مجمع قناة الكالسيوم المعتمد على إطلاق الكالسيوم (CRAC). ترتبط الشذوذات في وظيفة قناة CRAC بعدة اضطرابات، بما في ذلك نقص المناعة المشترك الشديد (SCID) ومتلازمة ستورموكين. تسلط هذه الفقرة الضوء على النقاش المستمر بشأن آليات التوضع المشترك لـ STIM1 و Orai1 عند تقاطعات الشبكة الإندوبلازمية/الغشاء البلازمي، مع انتقاد نموذج فخ الانتشار والتأكيد على دور S-acylation في تنظيم هذه البروتينات.
يقدم المؤلفون أدلة على أن S-acylation، التي تتوسطها بروتينات نقل الأحماض الدهنية (PATs) مثل DHHC21، ضرورية لوظيفة STIM1 و Orai1 بشكل صحيح، مما يؤثر على استقرارهما وتوضعهما. يظهرون أن DHHC21 ضروري لإشارات الكالسيوم في خلايا T وأن غيابه في نموذج فأر (فئران مُزالة الشعر) يؤدي إلى عيوب كبيرة في تنشيط خلايا T وتمايزها. تؤكد الدراسة أيضًا أن تعديل S-acylation لـ STIM1 متعطل في الفئران المُزالة الشعر، مما يؤدي إلى ضعف SOCE في خلايا الطحال. تشير النتائج إلى أن DHHC21 هو PAT الأساسي لـ STIM1، وأن نموذج الفأر المُزال الشعر قد يعمل كبديل لمتلازمة تضخم الغدد اللمفاوية الذاتية المناعية (ALPS)، مما يوفر رؤى حول تنظيم إشارات خلايا T والأهداف العلاجية المحتملة.
الطرق
في هذه الدراسة، تم زراعة خلايا HEK293T من النوع البري في وسط ديلبيكو المعدل (DMEM) معزز بمصل الجنين البقري، L-glutamine، والبنسلين-ستربتوميسين. تم إنتاج خلايا knockout لـ DHHC21 باستخدام تقنية CRISPR-Cas9، مع تأكيد تسلسلات sgRNA المحددة للـ knockout عبر Western blot. تضمنت الإعدادات التجريبية نقل الخلايا مع بلازميدات STIM1 و DHHC21، وتم استخدام أجسام مضادة متنوعة للتخطيط المناعي وتصوير المناعة الفلورية، تم الحصول عليها من موردين موثوقين. بالإضافة إلى ذلك، تضمنت الدراسة إنتاج طفرات DHHC21 واستخدام اختبارات acyl-RAC لتحليل البروتينات المعدلة S-acylated.
للتجارب في الجسم الحي، تم تربية الفئران من النوع البري والمُزالة الشعر (zdhhc21 dep) في ظروف خالية من مسببات الأمراض، مع توفير مكملات غذائية لتقليل الوفيات في الجراء المُزالة الشعر المتجانسة. تم إجراء تحليل الجينات باستخدام qPCR، وتم قياس عدد العدلات في الفئران الذكور والإناث التي تتراوح أعمارها بين 4-52 أسبوعًا. تضمنت اختبار acyl-RAC إعداد المستخلصات الغشائية وتركيز البروتين، تلاه تحليل من خلال SDS-PAGE وWestern blotting. تم إجراء التثبيط المناعي المشترك باستخدام مستخلصات البروتين المستمدة من الطحال من كل من الفئران WT والمُزالة الشعر، باستخدام أجسام مضادة محددة لعزل البروتينات المستهدفة لمزيد من التحليل.
النتائج
تظهر نتائج هذه الدراسة أن DHHC21 ضروري لتعديل S-acylation لـ STIM1، وهو مكون حاسم لإشارات الكالسيوم في خلايا T. باستخدام اختبار acyl-RAC، وجد الباحثون أن تعديل S-acylation لـ STIM1 كان منخفضًا بشكل ملحوظ في طحالات الفئران المُزالة الشعر، التي تمتلك طفرة (ΔF233) في DHHC21 تعطل ارتباط الكالمودولين وترتبط بضعف إشارات مستقبلات خلايا T (TCR) وتمايزها. من الجدير بالذكر أن مستويات S-acylation لـ DHHC21 و calnexin ظلت دون تغيير، وكانت مستويات البروتين الكلي لـ STIM1 و DHHC21 و calnexin متشابهة بين الفئران من النوع البري والفئران الطافرة.
كشفت التحقيقات الإضافية في دخول الكالسيوم المعتمد على المتجر (SOCE) أن خلايا الطحال المُزالة الشعر أظهرت مستويات عالية من الكالسيوم الأساسية وانخفاضًا كبيرًا في SOCE مقارنة بخلايا الطحال من النوع البري. تم تقييم ذلك من خلال استنفاد مخازن الكالسيوم في الشبكة الإندوبلازمية (ER) باستخدام الثابسيجرين وقياس دخول الكالسيوم عند إعادة إدخاله. تشير النتائج إلى أن DHHC21 هو المحفز الأساسي للدهون (PAT) لـ STIM1، مما يبرز دوره الحاسم في الحفاظ على توازن الكالسيوم وفعالية SOCE في خلايا T.
المناقشة
في هذه الدراسة، بحث المؤلفون في دور DHHC21 في دخول الكالسيوم المعتمد على المتجر (SOCE) وتأثيراته على وظيفة المناعة، وخاصة في سياق متلازمة تضخم الغدد اللمفاوية الذاتية المناعية (ALPS). باستخدام تصوير فائق الدقة ومجموعة متنوعة من اختبارات الخلايا، أظهروا أن DHHC21 ضروري لتعديل S-acylation لـ STIM1، وهو بروتين حاسم لـ SOCE. وجد الباحثون أن خلايا HEK293 knockout لـ DHHC21 أظهرت انخفاضًا كبيرًا في SOCE عند تحفيزها بواسطة الثابسيجرين (TG)، وأن التعبير عن DHHC21 من النوع البري يمكن أن يعيد هذا العيب بالكامل، بينما أعادت الطفرة ΔF233 SOCE جزئيًا فقط. يشير هذا إلى أن طفرة ΔF233 تؤثر على توازن الكالسيوم وتفاعل STIM1 دون أن تلغي تمامًا وظيفة DHHC21.
علاوة على ذلك، كشفت الدراسة أن الفئران المُزالة الشعر، التي تحمل طفرة ΔF233، أظهرت سمات ظاهرة تشبه ALPS، بما في ذلك تضخم الغدد اللمفاوية، تضخم الطحال، وزيادة علامات المصل الذاتية المناعية. استنتج المؤلفون أن طفرة ΔF233 في DHHC21 قد لا تمثل فقدانًا كاملاً لوظيفة ولكنها تمثل تأثيرًا مكتسبًا يعزز الارتباط بـ STIM1، مما يعطل إشارات الكالسيوم الطبيعية. تؤكد هذه النتائج على أهمية DHHC21 في إشارات خلايا T وتقترح أن الطفرات في هذا الجين قد تسهم في ALPS لدى المرضى الذين يفتقرون إلى طفرات جينية معروفة. هناك حاجة إلى مزيد من البحث لاستكشاف الآليات الكامنة وراء الظواهر الملحوظة والدور المحتمل لـ DHHC21 في اضطرابات المناعة الأخرى.
DOI: https://doi.org/10.1242/jcs.264681
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41279060
Publication Date: 2026-08-17
Author(s): Goutham Kodakandla et al.
Primary Topic: Ion Channels and Receptors
Overview
This section discusses the mechanism of store-operated calcium entry (SOCE), which is activated by the depletion of calcium from endoplasmic reticulum (ER) stores. The proteins STIM1 and STIM2 act as calcium sensors in the ER, undergoing conformational changes that enable them to interact with and activate Orai calcium channels on the plasma membrane. The authors demonstrate that both Orai1 and STIM1 undergo dynamic S-acylation following store depletion, a process that is dependent on the calcium-activated protein S-acyltransferase DHHC21.
The study establishes the essential role of DHHC21 in facilitating SOCE both in vitro and in vivo. Using a depilated mouse model that expresses DHHC21 but lacks its calcium activation, the authors reveal that DHHC21 activation is crucial for the S-acylation of STIM1 and subsequent calcium entry. Additionally, they observe that DHHC21 is recruited to Orai1/STIM1 complexes upon store depletion, where it physically associates with STIM1. The findings indicate that depilated mice exhibit symptoms resembling autoimmune lymphoproliferative syndrome (ALPS), including impaired Fas-mediated calcium release and increased serum vitamin B12 levels. The results highlight the significant role of dynamic S-acylation in second messenger signaling and immune function, suggesting that targeting DHHC21 could offer therapeutic avenues for ALPS and related disorders characterized by dysregulated STIM1 activation.
Introduction
The introduction discusses the critical role of intracellular calcium levels in regulating various physiological functions, particularly through the mechanism of store-operated calcium entry (SOCE). This process is initiated by the depletion of calcium stores in the endoplasmic reticulum (ER), activating the calcium sensor Stromal Interaction Molecule 1 (STIM1), which then interacts with the calcium channel Orai1 to form the calcium release-activated calcium (CRAC) channel complex. Abnormalities in CRAC channel function are linked to several disorders, including severe combined immunodeficiency (SCID) and Stormorken syndrome. The section highlights the ongoing debate regarding the mechanisms of STIM1 and Orai1 colocalization at ER/plasma membrane junctions, particularly critiquing the diffusion trap model and emphasizing the role of S-acylation in regulating these proteins.
The authors present evidence that S-acylation, mediated by palmitoyl acyltransferases (PATs) such as DHHC21, is crucial for the proper functioning of STIM1 and Orai1, influencing their stability and localization. They demonstrate that DHHC21 is essential for T cell calcium signaling and that its absence in a mouse model (depilated mice) leads to significant defects in T cell activation and differentiation. The study further establishes that STIM1 S-acylation is impaired in depilated mice, resulting in compromised SOCE in splenocytes. The findings suggest that DHHC21 is the primary PAT for STIM1, and the depilated mouse model may serve as an analog for autoimmune lymphoproliferative syndrome (ALPS), providing insights into the regulation of T cell signaling and potential therapeutic targets.
Methods
In this study, HEK293T wild-type cells were cultured in Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) supplemented with fetal bovine serum, L-glutamine, and penicillin-streptomycin. DHHC21 knockout cells were generated using CRISPR-Cas9 technology, with specific sgRNA sequences for the knockout confirmed via Western blot. The experimental setup involved transfecting cells with STIM1 and DHHC21 plasmids, and various antibodies were utilized for immunoblotting and immunofluorescence imaging, sourced from reputable suppliers. Additionally, the study involved the generation of DHHC21 mutants and the use of acyl-RAC assays to analyze the S-acylated proteome.
For in vivo experiments, wild-type and depilated (zdhhc21 dep) mice were bred under pathogen-free conditions, with dietary supplements provided to reduce mortality in homozygous depilated pups. Genotyping was performed using qPCR, and neutrophil counts were measured in male and female mice aged 4-52 weeks. The acyl-RAC assay involved lysate preparation and protein enrichment, followed by analysis through SDS-PAGE and Western blotting. Co-immunoprecipitation was conducted using spleen-derived protein lysates from both WT and depilated mice, employing specific antibodies to isolate target proteins for further analysis.
Results
The results of this study demonstrate that DHHC21 is essential for the S-acylation of STIM1, a critical component of calcium signaling in T cells. Using an acyl-RAC assay, the researchers found that STIM1 S-acylation was significantly reduced in the spleens of depilated mice, which possess a mutation (ΔF233) in DHHC21 that disrupts calmodulin binding and is associated with impaired T cell receptor (TCR) signaling and differentiation. Notably, the S-acylation levels of DHHC21 and calnexin remained unchanged, and total protein levels of STIM1, DHHC21, and calnexin were comparable between wild-type and mutant mice.
Further investigations into store-operated calcium entry (SOCE) revealed that depilated splenocytes exhibited elevated baseline calcium levels and significantly reduced SOCE compared to wild-type splenocytes. This was assessed by depleting endoplasmic reticulum (ER) calcium stores with thapsigargin and measuring calcium entry upon reintroduction. The findings indicate that DHHC21 is the primary palmitoyltransferase (PAT) for STIM1, underscoring its critical role in maintaining calcium homeostasis and efficient SOCE in T cells.
Discussion
In this study, the authors investigated the role of DHHC21 in store-operated calcium entry (SOCE) and its implications for immune function, particularly in the context of autoimmune lymphoproliferative syndrome (ALPS). Using super-resolution imaging and various cell assays, they demonstrated that DHHC21 is essential for the S-acylation of STIM1, a critical protein for SOCE. The researchers found that DHHC21 knockout HEK293 cells exhibited significantly reduced SOCE when induced by thapsigargin (TG), and that the expression of wild-type DHHC21 could fully rescue this defect, while the ΔF233 mutant only partially restored SOCE. This suggests that the ΔF233 mutation affects calcium homeostasis and STIM1 interaction without completely abolishing DHHC21’s function.
Furthermore, the study revealed that depilated mice, which harbor the ΔF233 mutation, exhibited phenotypic traits resembling ALPS, including lymphadenopathy, splenomegaly, and elevated serum markers of autoimmunity. The authors concluded that the ΔF233 mutation in DHHC21 may not represent a complete loss of function but rather a gain-of-function effect that enhances binding to STIM1, thereby disrupting normal calcium signaling. These findings underscore the importance of DHHC21 in T cell signaling and suggest that mutations in this gene could contribute to ALPS in patients lacking known genetic mutations. Future research is warranted to explore the mechanisms underlying the observed phenotypes and the potential role of DHHC21 in other immune-related disorders.