DOI: https://doi.org/10.1007/s11095-023-03648-0
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38263341
تاريخ النشر: 2024-01-23
المؤلف: Pouya Dehghani وآخرون
الموضوع الرئيسي: التطورات في توصيل الأدوية عبر الجلد
نظرة عامة
تدرس الدراسة استخدام الإكسوزومات كنظام توصيل للتوفاسيتينيب (TFC) في علاج الصدفية. الإكسوزومات، التي هي حويصلات خارج خلوية تتراوح من 40-150 نانومتر، معروفة بتسهيل التواصل بين الكيراتينوسيتات والخلايا المناعية من خلال علامات سطحية محددة. كانت الأبحاث تهدف إلى تقييم فعالية الإكسوزومات المحملة بالتوفاسيتينيب (TFC-Exo) من خلال مقارنة سميتها الخلوية، وكفاءة تحميل الدواء، وتأثيراتها العلاجية مقابل التوفاسيتينيب الحر. تم تحديد طريقة السونكيشن كأفضل تقنية لتحميل التوفاسيتينيب في الإكسوزومات. أشارت النتائج إلى أن TFC-Exo أظهرت سمية خلوية أقل، وقمعت بشكل كبير تعبير جينات السيتوكينات الالتهابية (TNFa، IL-23، IL-6، وIL-15)، وأظهرت تأثيرات علاجية متفوقة في نموذج صدفية مستحثة بالإيميكيومود في فئران BALB/c.
تشير النتائج إلى أن الإكسوزومات يمكن أن تعمل كحاملات فعالة لتوصيل الدواء المستهدف للتوفاسيتينيب، مما يعزز فعاليته العلاجية مع تقليل الآثار الجانبية أثناء الإدارة المزمنة. تسلط الدراسة الضوء على الدور الحاسم للكيراتينوسيتات في مسببات الصدفية وتؤكد على إمكانية التواصل الإكسوزومي في تعديل الاستجابات الالتهابية. يُوصى بإجراء أبحاث مستقبلية لاستكشاف التفاعلات بين خطوط الخلايا المختلفة المعنية في الصدفية ولتوضيح الآليات الكامنة وراء الفوائد العلاجية لتغليف الأدوية بالإكسوزومات.
مقدمة
تناقش مقدمة ورقة البحث الصدفية، وهي مرض مناعي ذاتي مزمن يؤثر على حوالي 2% من السكان العالميين، يتميز بفرط تنسج البشرة والتهاب مزمن بسبب نمو الكيراتينوسيتات غير المنضبط. يتضمن المرض تسلل خلايا المناعة مثل الخلايا الشجرية، البلعميات، خلايا T، والعدلات، مما يؤدي إلى مسارات التهابية متنوعة تساهم في لويحات الصدفية. بينما تكون العلاجات الموضعية فعالة للحالات الخفيفة إلى المتوسطة، فإن الطبيعة المزمنة للصدفية تتطلب علاجًا مستمرًا، وغالبًا ما تكون معقدة بسبب الآثار الجانبية من الأدوية الحالية. من الجدير بالذكر أن العلاجات التي تستهدف مسار الالتهاب TNF-IL-23-Th17، بما في ذلك مثبطات JAK مثل التوفاسيتينيب (TFC)، تظهر وعدًا في إدارة المرض من خلال قمع السيتوكينات الالتهابية الرئيسية.
تسلط الورقة الضوء أيضًا على دور الحويصلات خارج الخلوية، وخاصة الإكسوزومات المستمدة من الكيراتينوسيتات، في الوساطة التواصل داخل نسيج الجلد وإمكاناتها كوسائل توصيل للأدوية. هذه الإكسوزومات، التي تتميز بهيكلها ذو الطبقة الدهنية، يمكن أن تخترق الجلد بفعالية وتكون أقل سمية مقارنةً بحوامل الأدوية التقليدية. تعزز وجود علامات حيوية محددة، مثل CD9، قدرتها على تحميل وتوصيل الأدوية المثبطة للمناعة مثل TFC إلى الخلايا المستهدفة المعنية في التهاب الصدفية. تهدف الدراسة إلى تطوير نظام توصيل قائم على الإكسوزومات للتوفاسيتينيب لتحسين فعالية العلاج في نموذج صدفية مستحثة بالإيميكيومود، مع فرضية أن هذه الطريقة ستتفوق على التوفاسيتينيب الحر في استهداف الخلايا الالتهابية.
الطرق
في هذه الدراسة، تم استخدام طرق مختلفة لتحميل الدواء TFC في الإكسوزومات، مما أدى إلى تشكيل TFC-Exo. المواد المستخدمة تضمنت مضادات حيوية، ووسائط زراعة الخلايا، وعوامل لعزل الإكسوزومات، ومجموعات مختلفة لاستخراج RNA وتحليل PCR. تم تقييم خمس تقنيات تحميل متميزة: (1) حضانة TFC مع خلايا المتبرع، (2) حضانة مباشرة لـ TFC مع الإكسوزومات المعزولة، (3) دورات التجميد والذوبان، (4) سونكيشن بالمسبار، و(5) معالجة بحمام فوق صوتي. تضمنت كل طريقة ظروفًا محددة، مثل تركيزات TFC وأوقات الحضانة، لتحسين تحميل الدواء مع تقليل السمية الخلوية.
بعد عمليات التحميل، تم عزل TFC-Exo باستخدام الطرد المركزي مع أنبوب فلتر Amicon®، مما يضمن إزالة TFC غير المرتبط وأي دواء زائد قد يؤدي إلى إطلاق مبكر. تم تعليق المنتج النهائي في PBS للاستخدامات اللاحقة. تعتبر هذه الطريقة المنهجية لتحضير الإكسوزومات وتحميل الأدوية ضرورية لتعزيز الفعالية العلاجية للتوفاسيتينيب مع التخفيف من الآثار الجانبية المحتملة المرتبطة بإدارة الدواء الحر.
النتائج
في هذه الدراسة، تم تحليل مستويات التعبير لـ mRNA للسيتوكينات الرئيسية المعنية في الصدفية—TNF-α، IL-23، IL-6، وIL-15—باستخدام PCR في الوقت الحقيقي في زراعات خلايا خط A-431 المعالجة بظروف مختلفة، بما في ذلك الإكسوزومات الفارغة، والتوفاسيتينيب الحر، وTFC-Exo بتركيز 50 ميكرومتر، إلى جانب خلايا التحكم غير المعالجة على مدى 24 ساعة. أشارت النتائج إلى وجود اختلافات كبيرة في التعبير عن mRNA بين مجموعات العلاج (p < 0.05)، باستثناء IL-23، الذي أظهر مستويات مشابهة في التوفاسيتينيب الحر والخلايا غير المعالجة، وIL-6 وIL-15، اللذان أظهرا تعبيرًا متشابهًا في تركيبات علاجية محددة. من الجدير بالذكر أن وجود الإكسوزومات الفارغة أدى إلى زيادة كبيرة في تنظيم جميع جينات السيتوكينات مقارنةً بالتحكم غير المعالج، باستثناء IL-6. على العكس، أدى علاج TFC-Exo إلى مستويات تعبير جيني أقل بشكل ملحوظ لجميع السيتوكينات مقارنةً بمجموعة التوفاسيتينيب الحر بنفس التركيز. تشير هذه النتائج إلى أن الإكسوزومات المستمدة من الكيراتينوسيتات يمكن أن تعزز التعبير عن السيتوكينات الالتهابية في كيراتينوسيتات A-431، ولكن هذا التأثير يتم التخفيف منه تمامًا عند معالجة الخلايا بـ TFC-Exo.
المناقشة
في هذه الدراسة، تم استخدام خط خلايا سرطان الجلد البشري A-431 لعزل وتوصيف الإكسوزومات، التي تم تحميلها بعد ذلك بالتوفاسيتينيب (عامل علاجي) لتطبيقات توصيل الأدوية. تم استخراج الإكسوزومات باستخدام مجموعة عزل EXOCIB، مع التركيز على الحفاظ على النقاء من خلال استخدام وسائط خالية من المصل. أظهرت الإكسوزومات المعزولة حجم جزيئي متوسط يبلغ 55.2 ± 12 نانومتر، ومؤشر تباين (PDI) يبلغ 0.076 ± 0.02، وجهد زتا (-4.8 ± 1.26 مللي فولت)، مما يدل على نظام كولوييدي مستقر. تم تقييم طرق مختلفة لتحميل التوفاسيتينيب، حيث أظهرت طريقة السونكيشن بالمسبار أعلى كفاءة تحميل (30.70 ± 1.40%) وكفاءة إطلاق (67.5%) على مدى 24 ساعة، مما يظهر ملف إطلاق ثنائي الطور.
كشفت اختبارات السمية الخلوية في المختبر أن TFC-Exo أظهرت نسبة بقاء خلايا أعلى بشكل ملحوظ مقارنةً بالتوفاسيتينيب الحر بعد 24 ساعة، مع قيم IC50 تشير إلى تأثير سمية مخفض للدواء المحاط بالإكسوزوم. أظهرت الدراسات الحية على فئران BALB/c أن العلاجات باستخدام TFC-Exo في قاعدة كريم باردة قللت بشكل فعال من التهاب الجلد، كما تم قياسه من خلال سمك الأذن ومؤشر شدة منطقة الصدفية (PASI). أكدت التقييمات النسيجية المرضية أيضًا الفعالية العلاجية، حيث أظهرت انخفاضًا في فرط التقرن والالتهاب في المجموعات المعالجة. أشارت التحليلات الإحصائية إلى وجود اختلافات كبيرة بين مجموعات العلاج، مما يعزز إمكانية TFC-Exo كنظام توصيل دواء واعد للعلاجات المتعلقة بالجلد.
DOI: https://doi.org/10.1007/s11095-023-03648-0
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38263341
Publication Date: 2024-01-23
Author(s): Pouya Dehghani et al.
Primary Topic: Advancements in Transdermal Drug Delivery
Overview
The study investigates the use of exosomes as a delivery system for tofacitinib (TFC) in the treatment of psoriasis. Exosomes, which are extracellular vesicles ranging from 40-150 nm, are known to facilitate communication between keratinocytes and immune cells through specific surface biomarkers. The research aimed to evaluate the effectiveness of TFC-loaded exosomes (TFC-Exo) by comparing their cytotoxicity, drug loading efficiency, and therapeutic effects against free TFC. The probe sonication method was identified as the optimal technique for loading TFC into exosomes. Results indicated that TFC-Exo exhibited lower cytotoxicity, significantly suppressed the expression of pro-inflammatory cytokine genes (TNFa, IL-23, IL-6, and IL-15), and demonstrated superior therapeutic effects in an imiquimod-induced psoriasis model in BALB/c mice.
The findings suggest that exosomes can serve as effective carriers for targeted drug delivery of TFC, enhancing its therapeutic efficacy while minimizing side effects during chronic administration. The study highlights the critical role of keratinocytes in psoriasis pathogenesis and underscores the potential of exosomal communication in modulating inflammatory responses. Future research is recommended to explore the interactions among various cell lines involved in psoriasis and to further elucidate the mechanisms underlying the therapeutic benefits of exosomal drug encapsulation.
Introduction
The introduction of the research paper discusses psoriasis, a chronic autoimmune disease affecting approximately 2% of the global population, characterized by epidermal hyperplasia and chronic inflammation due to uncontrolled keratinocyte growth. The disease involves the infiltration of immune cells such as dendritic cells, macrophages, T cells, and neutrophils, leading to various inflammatory pathways that contribute to psoriatic plaques. While topical therapies are effective for mild to moderate cases, the chronic nature of psoriasis necessitates ongoing treatment, often complicated by side effects from current medications. Notably, therapies targeting the TNF-IL-23-Th17 inflammatory pathway, including the JAK inhibitors like tofacitinib (TFC), show promise in managing the disease by suppressing key inflammatory cytokines.
The paper also highlights the role of extracellular vesicles, particularly keratinocyte-derived exosomes, in mediating communication within skin tissue and their potential as drug delivery vehicles. These exosomes, characterized by their lipid bilayer structure, can penetrate the skin effectively and are less cytotoxic compared to traditional drug carriers. The presence of specific biomarkers, such as CD9, enhances their ability to load and deliver immunosuppressive drugs like TFC to target cells involved in psoriasis inflammation. The study aims to develop an exosome-based delivery system for TFC to improve treatment efficacy in an imiquimod-induced psoriasis mouse model, hypothesizing that this method will outperform free TFC in targeting inflammatory cells.
Methods
In this study, various methods were employed to load the drug TFC into exosomes, resulting in the formation of TFC-Exo. The materials used included antibiotics, cell culture media, reagents for exosome isolation, and various kits for RNA extraction and PCR analysis. Five distinct loading techniques were evaluated: (1) incubation of TFC with donor cells, (2) direct incubation of TFC with isolated exosomes, (3) freeze-thaw cycles, (4) probe sonication, and (5) ultrasonic bath treatment. Each method involved specific conditions, such as TFC concentrations and incubation times, to optimize drug loading while minimizing cytotoxicity.
Following the loading processes, TFC-Exo was isolated using centrifugation with an Amicon® filter tube, ensuring the removal of unbound TFC and any excess drug that could lead to premature release. The final product was suspended in PBS for subsequent applications. This systematic approach to exosome preparation and drug loading is crucial for enhancing the therapeutic efficacy of TFC while mitigating potential side effects associated with free drug administration.
Results
In this study, the expression levels of mRNA for key cytokines involved in psoriasis—TNF-α, IL-23, IL-6, and IL-15—were analyzed using Real-time PCR in A-431 cell line cultures treated with various conditions, including blank exosomes, free TFC, and TFC-Exo at a concentration of 50 μM, alongside control untreated cells over a 24-hour period. The results indicated significant differences in mRNA expression among the treatment groups (p < 0.05), with the exception of IL-23, which showed similar levels in free TFC and untreated cells, and IL-6 and IL-15, which exhibited comparable expression in specific treatment combinations. Notably, the presence of blank exosomes led to a significant upregulation of all cytokine genes compared to untreated controls, with the exception of IL-6. Conversely, the TFC-Exo treatment resulted in markedly lower gene expression levels for all cytokines when compared to the free TFC group at the same concentration. These findings suggest that keratinocyte-derived exosomes can enhance the expression of inflammatory cytokines in A-431 keratinocytes, but this effect is completely mitigated when cells are treated with TFC-Exo.
Discussion
In this study, the A-431 human epidermoid carcinoma cell line was utilized to isolate and characterize exosomes, which were subsequently loaded with TFC (a therapeutic agent) for drug delivery applications. Exosomes were extracted using an EXOCIB isolation kit, with a focus on maintaining purity by utilizing serum-free media. The isolated exosomes exhibited an average particle size of 55.2 ± 12 nm, a polydispersity index (PDI) of 0.076 ± 0.02, and a zeta potential of -4.8 ± 1.26 mV, indicating a stable colloidal system. Various methods for TFC loading were evaluated, with probe sonication yielding the highest loading efficiency (30.70 ± 1.40%) and release efficiency (67.5%) over 24 hours, demonstrating a biphasic release profile.
In vitro cytotoxicity assays revealed that TFC-Exo exhibited significantly higher cell viability compared to free TFC at 24 hours, with IC50 values indicating a reduced cytotoxic effect of the exosome-encapsulated drug. In vivo studies on BALB/c mice demonstrated that treatments with TFC-Exo in a cold cream base effectively reduced skin inflammation, as measured by ear thickness and the psoriasis area severity index (PASI). Histopathological evaluations further confirmed the therapeutic efficacy, showing reduced hyperkeratosis and inflammation in treated groups. Statistical analyses indicated significant differences between treatment groups, reinforcing the potential of TFC-Exo as a promising drug delivery system for skin-related therapies.