DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.07.020
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39127037
تاريخ النشر: 2024-08-09
المؤلف: Digvijay Singh وآخرون
الموضوع الرئيسي: الهيكل النووي والوظيفة
نظرة عامة
يعد معقد المسام النووي (NPC) ضروريًا للنقل النووي السيتوبلازمي، ومع ذلك، فإن هياكله المحيطية، وخاصة السلة النووية الشبيهة بالقفص، تظهر تباينًا كبيرًا عبر الأنواع المختلفة. تستخدم هذه الدراسة التصوير الإلكتروني بالتبريد داخل الخلايا وتحليل تحت المصفوفة للتحقيق في الاختلافات الهيكلية لـ NPC والسلة النووية في الفطريات (Saccharomyces cerevisiae)، والثدييات (Mus musculus)، والطلائعيات (Toxoplasma gondii).
من خلال النمذجة الهيكلية التكاملية، تقدم الأبحاث نموذجًا للسلة النووية في الخميرة والثدييات، موضحة التفاعل بين النوكليوبورينات (Nups) في الحلقة النووية وبروتينات Mlp/Tpr التي تشكل السلة. تعمل مجالات اللولب اللولبي لـ Mlp/Tpr كدعائم هيكلية، بينما تساهم نهاياتها غير المنظمة في كثافات السلة البعيدة، والتي قد تعمل كمواقع ربط لمعالجة mRNA قبل النقل عبر الغلاف النووي. تعزز هذه الأعمال فهمنا لهيكل NPC وتأثيراته الوظيفية في مراقبة mRNA وتنظيم الكروماتين.
مقدمة
يعد معقد المسام النووي (NPC) هيكلًا كبيرًا من الجزيئات الكبيرة مدفونة في الغلاف النووي، وهو أمر حاسم للنقل النووي السيتوبلازمي. يتكون من مئات البروتينات المعروفة باسم النوكليوبورينات (Nups)، يتميز NPC بعدة حلقات، بما في ذلك الحلقة النووية (NR)، الحلقة السيتوبلازمية (CR)، وحلقة داخلية (IR)، حيث تتكون كل حلقة عادةً من ثمانية وحدات فرعية متكررة. من الجدير بالذكر أن التكرارات الغنية بـ FG من Nups المختلفة تشكل قناة مركزية تتفاعل مع عوامل النقل. بالإضافة إلى ذلك، يحتوي NPC على سلة نووية، والتي تُعتبر مرتبطة بنقل mRNA وتنظيم الكروماتين، مع تحديد Nups معينة مثل Nup1 وNup2 وNup60 كعناصر رئيسية في الخميرة، ونظائرها الثديية بما في ذلك Nup153 وNup50.
كشفت الدراسات الحديثة التي تستخدم تقنيات التصوير المتقدمة عن هيكل السلة واحتمالية تباينها عبر الأنواع، ومع ذلك، لا تزال الأدوار الدقيقة لـ Nups الفردية غير واضحة. للتحقيق في هذه الاختلافات، أجرى المؤلفون تصويرًا إلكترونيًا بالتبريد داخل الخلايا (cryo-ET) على NPCs من ثلاثة كائنات حية حقيقية النواة متباينة: *Saccharomyces cerevisiae* (الخميرة)، *Mus musculus* (الفأر)، و*Toxoplasma gondii* (الطلائعيات الطفيلية). سمحت مجموعة البيانات الواسعة الخاصة بهم، التي تتكون من 1,604 سلسلة ميل، بتصنيف أنواع NPC المتميزة وتوضيح بنية السلة في كل من NPCs الثديية والخميرية. قدمت النمذجة الهيكلية التكاملية، التي تتضمن بيانات كيميائية حيوية، رؤى حول التنظيم الجزيئي والديناميات الوظيفية لـ Nups السلة، مما ساهم في فهم شامل لهيكل NPC عبر الأنواع المختلفة.
الطرق
تحدد قسم الطرق في ورقة البحث نهجًا شاملاً لدراسة معقدات المسام النووي (NPCs) من خلال تقنيات تجريبية متنوعة. تشمل المنهجيات الرئيسية زراعة الخلايا، التبريد، إعداد العينات، الحصول على سلسلة الميل، وتحليل تحت المصفوفة. تستخدم الدراسة قياسات المسافة الزوجية بين NPCs الخميرية ووظيفة توزيعها الشعاعي، إلى جانب الربط الكيميائي وتحليل الطيف الكتلي (CX-MS) لـ NPCs الخميرية المنقاة بال affinity. بالإضافة إلى ذلك، يتم إجراء نمذجة تكاملية لسلة NPC لتعزيز فهم دينامياتها الهيكلية.
كما يوضح القسم توفر الموارد الحيوية، بما في ذلك الأجسام المضادة والمواد الكيميائية والاختبارات التجارية، مع توفير معرفات محددة لإعادة الإنتاج. يتم التأكيد على توفر البيانات والرموز، مع إيداع خرائط التصوير الإلكتروني بالتبريد (Cryo-ET) والنماذج التكاملية في بنك بيانات المجهر الإلكتروني (EMDB) وPDB-Dev، على التوالي. يضمن المؤلفون أن السلالات وخطوط الخلايا المستخدمة في الدراسة يمكن طلبها دون قيود، مما يعزز الشفافية والوصول في البحث.
النتائج
في هذا القسم، يقدم المؤلفون النتائج من تحقيقهم في معقدات المسام النووي (NPCs) في الخميرة والطفيليات الأولية باستخدام التصوير الإلكتروني بالتبريد (cryo-ET). يحددون مجموعتين من معقدات المسام النووي الخميرية (yNPCs): تلك التي تحتوي على حلقة نووية واحدة (NR) وتلك التي تحتوي على NR مزدوجة. تكشف تحليلاتهم أن 73% من yNPCs خلال مرحلة النمو اللوجاريتمي تمتلك NR واحدة، بينما تظهر 27% المتبقية NR مزدوجة. من الجدير بالذكر أن هيكل السلة المستقر يُلاحظ فقط في النوع NR المزدوج، مما يشير إلى أن NR الواحدة قد لا تدعم سلة مستقرة. يستكشف المؤلفون أيضًا الهيكل الجزيئي للسلة في كل من NPCs الخميرية والثديية، كاشفين عن أوجه التشابه في الطبوغرافيا ولكن الاختلافات في الشكل العام.
بالإضافة إلى ذلك، تفحص الدراسة NPC الطلائعي (pNPC) وتجد أنه يتميز بـ NR مزدوج ولكن حلقة سيتوبلازمية (CR) غير مكتملة، والتي تفتقر إلى Y-complex كامل. يُلاحظ أن pNPC له قطر أصغر مقارنةً بـ yNPCs وNPCs الثديية (mNPCs). يصف المؤلفون هيكل السلة، الذي يتكون من دعائم تنبعث من NR المزدوج، ويبرزون وجود منطقة استبعاد حول السلة، والتي قد تسهل النقل النووي السيتوبلازمي. توفر نهجهم في النمذجة التكاملية رؤى حول الترتيب المكاني لمكونات السلة، كاشفين أن مناطق تكرار FG من النوكليوبورينات تواجه القناة المركزية، مما يفصل عمليات النقل عن أحداث الربط الأولية. بشكل عام، تسهم النتائج في فهم أعمق للتنوع الهيكلي والوظيفي لـ NPCs عبر الأنواع المختلفة.
المناقشة
تسلط المناقشة الضوء على التباين الهيكلي والقدرة الوظيفية لمعقدات المسام النووي (NPCs) عبر الأنواع المختلفة، مع التركيز بشكل خاص على الحلقات الخارجية (الحلقة السيتوبلازمية (CR) والحلقة النووية (NR)). تشير النتائج إلى أن الهيكلية المودولارية لـ NPC تسمح باكتساب أو فقدان تحت المجمعات، مما يمكّن من وظائف متنوعة. على سبيل المثال، يمتلك Toxoplasma gondii منصة تصدير mRNA كاملة ولكن CR غير مكتملة، مما يشير إلى أن Y-complex الكامل قد لا يكون ضروريًا لتصدير mRNA. تؤكد الدراسة أن الحلقة الداخلية (IR) لـ NPCs أكثر تحفظًا عبر الأنواع مقارنةً بالحلقات الخارجية، التي تظهر تباينًا كبيرًا في النسب.
تكشف الأبحاث أيضًا أن وجود عدة NRs أمر حاسم لاستقرار السلة النووية، وهي هيكل معني بتصدير mRNA وتنظيم الكروماتين. بشكل محدد، NR مزدوج ضروري لسلة مستقرة، بينما قد تكون NPCs ذات NR واحدة لها ارتباطات عابرة مع مكونات السلة. يتم التأكيد على الطبيعة الديناميكية للسلة، حيث يمكن أن تتغير استجابةً لظروف الخلايا واحتياجات نقل الحمولة. يقترح المؤلفون أن مرونة هيكل NPC تشبه جسر التعليق، حيث تجمع بين وحدات مرنة وصلبة لتلبية متطلبات وظيفية متنوعة، بما في ذلك نقل الجزيئات الكبيرة. يتم تشجيع التحقيقات المستقبلية لاستكشاف آثار تباين السلة ودورها في عمليات الاستيراد النووي، فضلاً عن التفاعلات بين NPCs والكروماتين.
القيود
تسلط قيود الدراسة الضوء على عدة تحديات حاسمة في تفسير النماذج الهيكلية للسلال النووية المستمدة من خرائط التصوير الإلكتروني بالتبريد (cryo-ET) للخميرة والفأر. تحدد الدقة الحالية لهذه الخرائط بناء نماذج هيكلية على مستوى البقايا، مما يجعل من الصعب تمييز الاختلافات الهيكلية الدقيقة بين النوعين. بينما يتم دعم نموذج السلة الخميرية ببيانات كيميائية حيوية واسعة، يعتمد نموذج الفأر على أوجه التشابه المستنتجة، مما يثير تساؤلات حول ما إذا كانت الاختلافات الملحوظة ناتجة عن تباينات نوعية أو حالات وظيفية متميزة.
بالإضافة إلى ذلك، تم استبعاد المكونات الرئيسية للسلة النووية، مثل yPml39/mZC3HC1، من النموذج بسبب نقص البيانات الكافية لتعريف مواقعها بدقة. تعقد عدم القدرة على تصور النوية في المصفوفات التوموغرافية داخل الخلايا للخميرة تفسير البيئة الخلوية المحيطة بمعقدات المسام النووي المختلفة (NPCs). هذا أمر ذو صلة خاصة نظرًا لأن المجهر الفلوري يشير إلى نقص في بروتينات السلة مثل Mlps بالقرب من النوية، مما يشير إلى اختلافات تركيبية محتملة في NPCs بناءً على سياقها المكاني داخل النواة.
DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.07.020
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39127037
Publication Date: 2024-08-09
Author(s): Digvijay Singh et al.
Primary Topic: Nuclear Structure and Function
Overview
The nuclear pore complex (NPC) is essential for nucleocytoplasmic transport, yet its peripheral structures, particularly the cage-like nuclear basket, exhibit significant variability across different species. This study employs in-cell cryo-electron tomography and subtomogram analysis to investigate the structural differences of the NPC and the nuclear basket in fungi (Saccharomyces cerevisiae), mammals (Mus musculus), and protozoa (Toxoplasma gondii).
Through integrative structural modeling, the research presents a model of the nuclear basket in yeast and mammals, elucidating the interaction between nucleoporins (Nups) in the nuclear ring and the Mlp/Tpr proteins that form the basket. The coiled-coil domains of Mlp/Tpr act as structural struts, while their unstructured termini contribute to the distal densities of the basket, which may function as docking sites for mRNA preprocessing prior to transport across the nuclear envelope. This work enhances our understanding of the NPC’s architecture and its functional implications in mRNA surveillance and chromatin organization.
Introduction
The nuclear pore complex (NPC) is a large macromolecular structure embedded in the nuclear envelope, crucial for nucleocytoplasmic transport. Composed of hundreds of proteins known as nucleoporins (Nups), the NPC features multiple rings, including the nuclear ring (NR), cytoplasmic ring (CR), and an inner ring (IR), with each ring typically consisting of eight repeating subunits. Notably, FG-rich repeats from various Nups form a central channel that interacts with transport factors. Additionally, the NPC contains a nuclear basket, which is implicated in mRNA transport and chromatin organization, with specific Nups such as Nup1, Nup2, and Nup60 identified as key components in yeast, and their mammalian counterparts including Nup153 and Nup50.
Recent studies utilizing advanced imaging techniques have revealed the basket’s structure and its potential variability across species, yet the precise roles of individual Nups remain unclear. To investigate these variations, the authors conducted in-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) on NPCs from three divergent eukaryotic organisms: *Saccharomyces cerevisiae* (yeast), *Mus musculus* (mouse), and *Toxoplasma gondii* (parasitic protozoa). Their extensive dataset, comprising 1,604 tilt series, allowed for the classification of distinct NPC variants and the elucidation of basket architecture in both mammalian and yeast NPCs. Integrative structural modeling, incorporating biochemical data, provided insights into the molecular organization and functional dynamics of basket Nups, contributing to a comprehensive understanding of NPC structure across different species.
Methods
The methods section of the research paper outlines a comprehensive approach to studying nuclear pore complexes (NPCs) through various experimental techniques. Key methodologies include cell culture, vitrification, sample preparation, tilt series acquisition, and subtomogram analysis. The study employs pairwise distance measurements among yeast NPCs and their radial distribution function, alongside chemical cross-linking and mass spectrometry (CX-MS) analysis of affinity-purified yeast NPCs. Additionally, integrative modeling of the NPC basket is performed to enhance understanding of its structural dynamics.
The section also details the availability of critical resources, including antibodies, chemicals, and commercial assays, with specific identifiers provided for reproducibility. Data and code availability are emphasized, with cryo-electron tomography (Cryo-ET) maps and integrative models deposited in the Electron Microscopy Data Bank (EMDB) and PDB-Dev, respectively. The authors ensure that strains and cell lines used in the study can be requested without restriction, promoting transparency and accessibility in research.
Results
In this section, the authors present findings from their investigation of nuclear pore complexes (NPCs) in yeast and protozoan parasites using cryo-electron tomography (cryo-ET). They identify two populations of yeast nuclear pore complexes (yNPCs): those with a single nuclear ring (NR) and those with a double NR. Their analysis reveals that 73% of yNPCs during log-phase growth possess a single NR, while the remaining 27% exhibit a double NR. Notably, a stable basket structure is observed only in the double NR variant, suggesting that the single NR may not support a stable basket. The authors also explore the molecular architecture of the basket in both yeast and mammalian NPCs, revealing similarities in topology but differences in overall shape.
Additionally, the study examines the protozoan NPC (pNPC) and finds it features a double NR but an incomplete cytoplasmic ring (CR), which lacks a full-length Y-complex. The pNPC is noted for its smaller diameter compared to yNPCs and mammalian NPCs (mNPCs). The authors describe the basket structure, consisting of struts emanating from the double NR, and highlight the presence of an exclusion zone around the basket, which may facilitate nucleocytoplasmic transport. Their integrative modeling approach provides insights into the spatial arrangement of basket components, revealing that the FG repeat regions of nucleoporins face the central channel, thereby segregating transport processes from initial docking events. Overall, the findings contribute to a deeper understanding of the structural and functional diversity of NPCs across different species.
Discussion
The discussion highlights the structural variability and functional adaptability of nuclear pore complexes (NPCs) across different species, particularly focusing on the outer rings (cytoplasmic ring (CR) and nuclear ring (NR)). The findings suggest that the NPC’s modular architecture allows for the gain or loss of subcomplexes, enabling diverse functionalities. For instance, Toxoplasma gondii possesses a complete mRNA export platform but an incomplete CR, indicating that the full Y-complex may not be essential for mRNA export. The study emphasizes that the inner ring (IR) of NPCs is more conserved across species than the outer rings, which exhibit significant stoichiometric variation.
The research also reveals that the presence of multiple NRs is critical for the stability of the nuclear basket, a structure involved in mRNA export and chromatin organization. Specifically, a double NR is necessary for a stable basket, while single NR NPCs may have transient associations with basket components. The dynamic nature of the basket is underscored, as it can change in response to cellular conditions and cargo transport needs. The authors propose that the structural resilience of the NPC is akin to a suspension bridge, combining flexible and rigid modules to accommodate various functional demands, including the transport of large macromolecules. Future investigations are encouraged to explore the implications of basket variability and its role in nuclear import processes, as well as the interactions between NPCs and chromatin.
Limitations
The study’s limitations highlight several critical challenges in interpreting the structural models of nuclear baskets derived from cryo-electron tomography (cryo-ET) maps of yeast and mouse. The current resolution of these maps restricts the construction of residue-level structural models, making it difficult to discern the precise structural differences between the two species. While the yeast basket model is supported by extensive biochemical data, the mouse model relies on inferred similarities, which raises questions about whether the observed differences are due to species-specific variations or distinct functional states.
Additionally, key components of the nuclear basket, such as yPml39/mZC3HC1, were excluded from the model due to a lack of sufficient data to accurately define their positions. The inability to visualize the nucleolus in the in-cell tomograms of yeast further complicates the interpretation of the cellular environment surrounding different nuclear pore complexes (NPCs). This is particularly relevant given that fluorescence microscopy indicates a depletion of basket proteins like Mlps near the nucleolus, suggesting potential compositional differences in NPCs based on their spatial context within the nucleus.