DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-026-70265-x
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41792128
تاريخ النشر: 2026-03-06
المؤلف: Zheng Liu وآخرون
الموضوع الرئيسي: تحفيز الإنزيمات وتثبيتها
نظرة عامة
تسلط الأبحاث الضوء على التقدمات الكبيرة في تخليق الأحماض الأمينية غير الكانونية (ncAAs)، مع التركيز بشكل خاص على الأحماض الأمينية D-aromatic ذات الفروع β، والتي تعتبر حيوية لفعالية الأدوية بسبب تأثيرها على التكوين المكاني وخصائص الدواء. على الرغم من أهميتها، كانت طرق التخليق الفعالة لهذه المركبات محدودة، مما أعاق دراسات العلاقة بين الهيكل والنشاط (SAR).
يقدم المؤلفون نهجًا جديدًا يستخدم إنزيم BsDAAT المعتمد على PLP من سلالة Bacillus sp. YM-1 للتخليق غير المتماثل لنظائر الأحماض الأمينية D-aromatic ذات الفروع β. تستخدم هذه الطريقة عملية فصل حركي ديناميكي (DKR)، مما يؤدي إلى عوائد عالية (تصل إلى 99%)، ونسب دياستيرومرية ممتازة (dr > 20:1)، وزيادة في النسبة الإنانية (ee تصل إلى 99%). علاوة على ذلك، تم دمج الأحماض الأمينية D-aromatic ذات الفروع β التي تم تخليقها بنجاح في تعديلات لعامل مضاد الأورام Lanreotide، مما يوضح التطبيق العملي لهذه المركبات في تطوير الأدوية.
مقدمة
تكتسب الأحماض الأمينية D (DAAs)، وهي النظائر الإنانية للأحماض الأمينية L (LAAs)، اهتمامًا في الكيمياء الطبية، وعلوم المواد، والتكنولوجيا الحيوية بسبب أدوارها البيولوجية الفريدة وتطبيقاتها المتنوعة. على الرغم من أنها أقل شيوعًا في الطبيعة، إلا أن DAAs مثل D-serine (D-Ser) وD-aspartic acid (D-Asp) تعتبر مهمة في أنسجة الفقاريات، وخاصة في الجهاز العصبي المركزي والأعضاء الصماء. كما تظهر DAAs في مختلف الأدوية، بما في ذلك المضادات الحيوية والعوامل الكيميائية. ومن الجدير بالذكر أن دراسات العلاقة بين الهيكل والنشاط تشير إلى أن LAAs المعدلة β تظهر خصائص دوائية وديناميكية دوائية محسنة، ومع ذلك لا يزال إمكانات DAAs المستبدلة β لتحسين الفعالية العلاجية غير مستكشفة.
لقد سهلت التقدمات الأخيرة في التحفيز الحيوي التخليق غير المتماثل للأحماض الأمينية L المستبدلة β، باستخدام إنزيمات مثل الليازات والترانسامينازات. تم تطوير طرق مبتكرة، مثل الفصل الحركي الديناميكي (DKR)، لتخليق هذه المركبات. ومع ذلك، لا يزال التخليق الإنزيمي للأحماض الأمينية D-aromatic ذات الفروع β قيد البحث. يقدم المؤلفون عملية DKR جديدة تستخدم نظام BsDAAT، الذي يسمح بالتداخل السريع بين نظائر الكيتوحمض، مما يحول الانتيمر السريع التفاعل (R) إلى DAAs المستبدلة β. يظهر هذا النهج التحفيزي الحيوي كفاءة عالية، حيث يحقق عوائد تصل إلى 99% وانتقائيات استيريو تفوق 20:1 في النسب الدياستيرومرية و>99% في الزيادة الإنانية.
طرق
في هذه الدراسة، تم بناء مكتبة طفرات باستخدام استراتيجية FRISM، مستهدفة بقايا الأحماض الأمينية ضمن نطاق 5 Å من الموقع النشط لإنزيم BsDAAT. بدأت العملية بتضخيم PCR لبلازميد BsDAAT-WT (pET-22b) كقالب. تضمنت مكونات تفاعل PCR ddH2O، وKOD 10X buffer، وdNTPs، وبدائل أمامية وصامتة، وبلازميد القالب، وMgSO4، وKOD plus، مع ظروف دورة حرارية محددة: إنكار أولي عند 94 درجة مئوية لمدة دقيقتين، تليها 30 دورة من الإنكار عند 94 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، وتبريد عند 61 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، وتمديد عند 68 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، مع انتهاء بتمديد نهائي عند 68 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
لإزالة بلازميد القالب، تم معالجة منتج PCR مع DpnI طوال الليل عند 37 درجة مئوية. تم تنقية المنتج الناتج باستخدام مجموعة تنقية GeneJET PCR، وتم تحويل 15 ميكرولتر من المنتج المنقى إلى خلايا E. coli BL21 (DE3) القابلة للتحويل عبر طريقة تحويل كيميائية. بعد التحويل، تم حضانة الخلايا في وسط LB وتم زراعتها على LB-agar المحتوي على الكاربيسليلين. تم بعد ذلك زراعة مستعمرة واحدة، وتم إجراء استخراج البلازميد باستخدام مجموعة EasyPure® Plasmid MiniPrep، وتم إجراء تسلسل DNA بواسطة Sangon Biotech لتأكيد الطفرات.
النتائج
في هذه الدراسة، استكشف المؤلفون استخدام إنزيم D-phenylalanine aminotransferase (DAAT) من *Bacillus sp. YM-1* لتخليق الأحماض الأمينية D-aromatic المستبدلة β من خلال فصل حركي ديناميكي (DKR) محفز بالإنزيم. أسفرت التجارب الأولية باستخدام حمض 2-أوكسي-3-فينيلبيوتانيك عن كميات منخفضة من المنتج على الرغم من الانتقائية الاستيريو العالية. أدت الاختبارات اللاحقة باستخدام خلايا كاملة تعبر عن DAAT إلى منتجات غير انتقائية استيريو، مما أدى إلى الاستنتاج بأن إنزيمات E. coli الذاتية كانت أيضًا تحفز التفاعل. كشفت تحسينات ظروف التفاعل أن استخدام D-Lys كمانح للأحماض الأمينية حسن العوائد بشكل كبير، حيث حقق عائدًا يتجاوز 99% ونسبة انتقائية استيريو أكبر من 20:1 تحت ظروف محددة.
كما قيمت الدراسة مجموعة متنوعة من الأحماض الكيتونية α ذات الفروع β، مما أظهر أن الركائز التي تحتوي على مجموعات سحب الإلكترون وسلاسل ألكيل كارهة للماء تم تحويلها بفعالية، بينما أظهرت تلك التي تحتوي على مجموعات β أكبر أو بعض الاستبدالات انخفاضًا في التفاعل. ومن الجدير بالذكر أن الطفرات الموجهة لموقع DAAT حددت المتغيرات V33F وV33A، التي حسنت الانتقائية الاستيريو والعائد عبر مجموعة من الركائز. تم تكبير التخليق الناجح لمشتقات β-Me-D-Phe لتطبيقات محتملة في تخليق الببتيدات في الطور الصلب لنظائر Lanreotide، مما يبرز كفاءة النظام التحفيزي الحيوي وفوائده البيئية. ستركز الأعمال المستقبلية على تطوير DAAT لتحسين إنتاج الأحماض الأمينية D الأليفاتية واستكشاف cascades متعددة الإنزيمات للتطبيقات الصناعية.
مناقشة
في هذه الدراسة، تم تحقيق التخليق الإنزيمي للأحماض الأمينية D-aromatic ذات الفروع β باستخدام إنزيم BsDAAT في عملية فصل حركي ديناميكي (DKR). تضمنت التفاعل إضافة كيتونات α مناسبة وفوسفات البيريدوكسال (PLP) إلى محلول فوسفات البوتاسيوم يحتوي على D-Lys، تليها حضانة مع إنزيم BsDAAT البري أو المتحور. تم تنقية المنتجات الناتجة وتوصيفها باستخدام ^1H NMR و^13C NMR، مما يؤكد العوائد العالية (تصل إلى 99%) ونسب دياستيرومرية ممتازة (dr) تتجاوز 20:1، جنبًا إلى جنب مع قيم الزيادة الإنانية (ee) التي تزيد عن 99%.
تسلط النتائج الضوء على كفاءة إنزيم BsDAAT في تحفيز التخليق غير المتماثل لمشتقات الأحماض الأمينية D، مع التركيز على تأثير المتغيرات الإنزيمية مثل V33F وV33A على نتائج التفاعل. ومن الجدير بالذكر أن الطفرة V33F أظهرت أداءً متفوقًا، حيث حققت عوائد تصل إلى 99% مع الحفاظ على نسب dr وee عالية. لا توسع هذه الأبحاث فقط مجموعة الأدوات لتخليق الأحماض الأمينية D، بل تؤكد أيضًا على إمكانات الإنزيمات المهندسة في التحفيز الحيوي، مما يمهد الطريق للتطبيقات المستقبلية في تطوير الأدوية.
DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-026-70265-x
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41792128
Publication Date: 2026-03-06
Author(s): Zheng Liu et al.
Primary Topic: Enzyme Catalysis and Immobilization
Overview
The research highlights significant advancements in the synthesis of non-canonical amino acids (ncAAs), particularly focusing on β-branched aromatic D-amino acids, which are vital for pharmaceutical efficacy due to their influence on spatial conformation and pharmacokinetic properties. Despite their importance, efficient synthesis methods for these compounds have been limited, impeding structure-activity relationship (SAR) studies.
The authors present a novel approach utilizing PLP-dependent transaminase BsDAAT from Bacillus sp. strain YM-1 for the asymmetric synthesis of β-branched aromatic D-amino acid analogues. This method employs a dynamic kinetic resolution (DKR) process, resulting in high yields (up to 99%), excellent diastereomeric ratios (dr > 20:1), and enantiomeric excess (ee up to 99%). Furthermore, the synthesized β-branched aromatic D-amino acids were successfully incorporated into modifications of the antineoplastic agent Lanreotide, demonstrating the practical application of these compounds in drug development.
Introduction
D-amino acids (DAAs), the enantiomers of L-amino acids (LAAs), are gaining attention in medicinal chemistry, material science, and biotechnology due to their unique biological roles and diverse applications. Although less common in nature, DAAs such as D-serine (D-Ser) and D-aspartic acid (D-Asp) are significant in vertebrate tissues, particularly in the central nervous system and endocrine organs. DAAs also feature in various pharmaceuticals, including antibiotics and chemotherapeutic agents. Notably, structure-activity relationship studies suggest that β-modified LAAs exhibit enhanced pharmacokinetic and pharmacodynamic properties, yet the potential of β-substituted DAAs to improve therapeutic efficacy remains unexplored.
Recent advancements in biocatalysis have facilitated the asymmetric synthesis of β-substituted L-amino acids, employing enzymes like lyases and transaminases. Innovative methods, such as dynamic kinetic resolution (DKR), have been developed for synthesizing these compounds. However, the enzymatic synthesis of aromatic DAAs with β-branches is still under-researched. The authors present a novel DKR process utilizing the BsDAAT system, which allows for the rapid interconversion of ketoacid enantiomers, selectively transforming the fast-reacting (R)-enantiomer into β-substituted DAAs. This biocatalytic approach demonstrates high efficiency, achieving yields of up to 99% and stereoselectivities exceeding 20:1 in diastereomeric ratios and >99% enantiomeric excess.
Methods
In this study, a mutant library was constructed using the FRISM strategy, targeting amino acid residues within a 5 Å range of the active site of BsDAAT. The process began with PCR amplification of the BsDAAT-WT plasmid (pET-22b) as the template. The PCR reaction mixture included ddH2O, KOD 10X buffer, dNTPs, forward and silent reverse primers, template plasmid, MgSO4, and KOD plus, with specific thermal cycling conditions: an initial denaturation at 94 °C for 2 minutes, followed by 30 cycles of denaturation at 94 °C for 15 seconds, annealing at 61 °C for 30 seconds, and extension at 68 °C for 10 minutes, concluding with a final extension at 68 °C for 10 minutes.
To eliminate the template plasmid, the PCR product was treated with DpnI overnight at 37 °C. The resulting product was purified using a GeneJET PCR purification kit, and 15 μL of the purified product was transformed into E. coli BL21 (DE3) competent cells via a chemical transformation method. Following transformation, the cells were incubated in LB medium and plated on LB-agar containing carbenicillin. A single colony was subsequently cultured, and plasmid extraction was performed using an EasyPure® Plasmid MiniPrep Kit, with DNA sequencing conducted by Sangon Biotech to confirm the mutations.
Results
In this study, the authors explored the use of D-phenylalanine aminotransferase (DAAT) from *Bacillus sp. YM-1* for the synthesis of aromatic β-substituted D-amino acids through enzyme-catalyzed dynamic kinetic resolution (DKR). Initial experiments with racemic 2-oxo-3-phenylbutanoic acid yielded low product amounts despite high stereoselectivity. Subsequent tests using whole cells expressing DAAT resulted in non-stereospecific products, leading to the conclusion that endogenous E. coli enzymes were also catalyzing the reaction. Optimization of reaction conditions revealed that using D-Lys as an amino donor significantly improved yields, achieving over 99% yield and a stereoselectivity ratio greater than 20:1 under specific conditions.
The study further assessed various β-branched α-ketoacids, demonstrating that substrates with electron-withdrawing groups and hydrophobic alkyl chains were effectively transformed, while those with larger β-groups or certain substitutions showed reduced reactivity. Notably, site-directed mutagenesis of DAAT identified variants V33F and V33A, which enhanced stereoselectivity and yield across a range of substrates. The successful synthesis of β-Me-D-Phe derivatives was scaled up for potential applications in solid-phase peptide synthesis of Lanreotide analogues, highlighting the biocatalytic system’s efficiency and environmental benefits. Future work will focus on evolving DAAT for improved production of aliphatic D-amino acids and exploring multi-enzyme cascades for industrial applications.
Discussion
In this study, the enzymatic synthesis of β-branched aromatic D-amino acids was achieved using the enzyme BsDAAT in a dynamic kinetic resolution (DKR) process. The reaction involved the addition of suitable α-ketoacids and pyridoxal phosphate (PLP) to a potassium phosphate buffer containing D-Lys, followed by incubation with either the wild-type or mutant BsDAAT enzyme. The resulting products were purified and characterized using ^1H NMR and ^13C NMR, confirming high yields (up to 99%) and excellent diastereomeric ratios (dr) exceeding 20:1, alongside enantiomeric excess (ee) values greater than 99%.
The findings highlight the efficiency of the BsDAAT enzyme in catalyzing the asymmetric synthesis of D-amino acid derivatives, with a focus on the impact of enzyme variants such as V33F and V33A on reaction outcomes. Notably, the V33F mutant demonstrated superior performance, achieving yields of 99% and maintaining high dr and ee ratios. This research not only expands the toolkit for synthesizing D-amino acids but also underscores the potential of engineered enzymes in biocatalysis, paving the way for future applications in pharmaceutical development.