DOI: https://doi.org/10.1248/cpb.c25-00710
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41621952
تاريخ النشر: 2026-01-29
المؤلف: Fumihiro Kawagoe وآخرون
الموضوع الرئيسي: كيمياء النقر والتطبيقات
نظرة عامة
في هذا البحث، تم تصميم وتخليق اثني عشر نظيراً فلورينياً لسلسلة جانبية من 2α-[2-(تترازول-2-يل)إيثيل]-1α،25-ديهيدروكسي فيتامين D3 (AH-1) لتقييم أنشطتها البيولوجية. استخدم التخليق تفاعل اقتران تروست المحفز بالبلاتين الذي يتضمن برومو-أوليفينات فلورينية من حلقة CD وسلسلة جانبية وموحد A-ring. ومن الجدير بالذكر أن بعض النظائر، وخاصة C26،27-هيكسافلورو-AH-1 (31) و24،24-ثنائي فلورو-AH-1 (34)، أظهرت زيادة ملحوظة في قوة الارتباط بمستقبل فيتامين D البشري (hVDR)، وزيادة النشاط النسخي في مجال ارتباط VDR-ligand (VDR-LBD)، ومقاومة أكبر للتفاعل غير النشط الذي يسببه CYP24A1 مقارنة بالمعيار 1α،25(OH)2D3.
نجحت الدراسة في تخليق هذه الاثني عشر نظيراً وتقييم خصائصها البيولوجية، مما كشف أن بعض المركبات تظهر ملفات نشاط متفوقة. بينما كان التركيز على قوة الارتباط بمستقبل hVDR من النوع البري، تم تسليط الضوء على إمكانية ارتباط هذه النظائر بشكل فعال بمستقبلات VDR الطافرة المرتبطة بالكساح من النوع الثاني، نظرًا للاكتشافات السابقة التي تشير إلى أن AH-1 يرتبط بقوة أكبر بالطافرة R274L. تم التخطيط لأبحاث مستقبلية لاستكشاف أنشطة هذه النظائر ضد مستقبلات VDR الطافرة وتقييم آثارها في نماذج الفئران للكساح من النوع الثاني وهشاشة العظام.
مقدمة
تناقش مقدمة هذه الورقة البحثية تطوير وتقييم بيولوجي لنظائر فيتامين D₃ النشطة المستبدلة بـ 2α، مع التركيز بشكل خاص على زيادة قوة الارتباط بمستقبل فيتامين D (VDR) والنشاط المحفز. ومن الجدير بالذكر أن النظائر مثل 2α-(3-هيدروكسي بروبوكسي)-1α،25(OH)₂D₃ و2α-(3-هيدروكسي بروبيل)-19-نور-1α،25(OH)₂D₃ أظهرت أنها تثبت مجال ارتباط hVDR-ligand من خلال تشكيل روابط هيدروجينية جديدة وإزالة جزيئات الماء من مركب الربط. أظهر المركب 2α-[2-(تترازول-2-يل)إيثيل]-1α،25-ديهيدروكسي فيتامين D₃ (AH-1) تأثيرات علاجية كبيرة في نموذج الفئران المستأصلة المبيض من هشاشة العظام، مما يعزز كثافة المعادن في العظام دون التسبب في فرط كالسيوم الدم، وأظهر تقاربًا أعلى لمستقبل VDR البشري المتحور المرتبط بالكساح الوراثي المعتمد على فيتامين D من النوع الثاني.
بالإضافة إلى ذلك، تبرز الورقة تخليق نظائر فيتامين D₃ الفلورية من السلسلة الجانبية، والتي تم تصميمها لمقاومة الأيض المعتمد على CYP24A1 وتعديل الأنشطة البيولوجية. أحد هذه النظائر، فالكالسيتريول، يستخدم حاليًا سريريًا لعلاج فرط نشاط جارات الدرق الثانوية. يؤكد المؤلفون على أهمية تعديلات السلسلة الجانبية الفلورية، التي تؤثر بشكل كبير على النشاط البيولوجي لـ 25-هيدروكسي فيتامين D₃. تقدم الدراسة تخليقًا شاملاً لـ 12 نظيرًا جديدًا من فلور-AH-1 وأنشطتها البيولوجية، بهدف توضيح تأثيرات موضع ذرة الفلور، العدد، والهيكل الفراغي على قوة ارتباط VDR ومقاومة الأيض.
طرق
في هذه الدراسة، تم استخدام تقنيات تحليلية متنوعة لتوصيف المركبات التي تم تخليقها. تم تسجيل طيف الرنين المغناطيسي النووي للبروتون ($^1$H) والكربون ($^{13}$C) باستخدام أجهزة مطياف JEOL AL-400 (400 ميغاهيرتز) وECP-600 (600 ميغاهيرتز)، مع الإشارة إلى $^1$H-NMR إلى رباعي ميثيل السيليكون (TMS) عند δ 0.00 جزء في المليون أو كلوروفورم (CHCl$_3$) عند δ 7.26 جزء في المليون، و$^{13}$C-NMR تم الإشارة إليه إلى كلوروفورم ديوتيري (CDCl$_3$) عند δ 77.0 جزء في المليون. تم الحصول على أطياف الأشعة تحت الحمراء (IR) باستخدام مطياف JASCO FT-IR-800، بينما تم إجراء قياس الطيف الكتلي عالي الدقة على مطياف الكتلة SHIMADZU LCMS-IT-TOF باستخدام التأين بالرش الكهربائي (ESI).
تم قياس التدويرات البصرية باستخدام مقياس قطبية رقمي JASCO DIP-370، وتم إجراء كروماتوغرافيا العمود باستخدام هلام السيليكا 60N وهلام السيليكا 60 في ظروف جافة في جو من الأرجون. تم توفير أطياف $^1$H و$^{13}$C-NMR التفصيلية للمركبات الجديدة (29-40، 54-58، و62-65) في المواد التكميلية.
النتائج
في هذا القسم، يوضح المؤلفون الاستراتيجية التخليقية المستخدمة لبناء سلسلة من هياكل فيتامين D3 الثلاثية، كما هو موضح في الرسم البياني 1. تم تخليق وحدة الثلاثية باستخدام طريقة اقتران تروست المحفز بالبلاتين، بينما تم إعداد أجزاء السلسلة الجانبية (F-CD-ring) من خلال طرق تم تأسيسها مسبقًا. تم اشتقاق جزء A-ring enyne من ميثيل α-D-غلوكوبيرانويد، وبدأ تخليق اثني عشر حلقة 8-أوكسي-CD مع هذه الحلقات الجانبية F-CD. ومن الجدير بالذكر أن حلقة CD 59 تم استخدامها في تخليق مشتقات 24،24-ثنائي فلورو-1،3-سيز-25-ديهيدروكسي-19-نور فيتامين D3.
تم تحويل حلقات 8-أوكسي-CD التي تم تخليقها لاحقًا إلى برومو أوليفينات، والتي تم اقترانها بعد ذلك مع سلف A-ring enyne باستخدام تفاعل اقتران تروست، مما أدى إلى الحصول على الهياكل الثلاثية المرغوبة من فيتامين D3. ومع ذلك، أشار المؤلفون إلى تشكيل نواتج ثانوية غير معروفة أثناء التخليق، مما أدى إلى عوائد منخفضة لعدة منتجات نهائية، وخاصة المركبات 31 و32 و36 و40. تم استخدام الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) لتأكيد عوائد المركبات المختارة، مما يبرز التحديات التي واجهت في التنقية وتحسين عوائد المنتجات.
المناقشة
في هذا القسم، تم إجراء التقييم البيولوجي لـ 12 نظيرًا صناعيًا من فلور-AH-1 (29-40)، مع استخدام 1α،25(OH)₂D₃ كتحكم إيجابي. تم تقييم قوة ارتباط هذه المركبات بمستقبل فيتامين D البشري (hVDR)، مما كشف أن النظائر 29-35 أظهرت قوى ارتباط مشابهة أو متفوقة مقارنة بالربط الطبيعي. ومن الجدير بالذكر أن النظائر 24،24-ثنائي فلورو و(23R)-فلورو (34، 35) أظهرت قوى ارتباط محسنة بشكل ملحوظ (224% و205%، على التوالي)، مما يشير إلى أن استبدالات الفلور المحددة يمكن أن تحسن بشكل كبير من تقارب VDR. على العكس، أظهرت المركبات 36-40، التي تحتوي على فلورة عند C23 في التكوين (S) أو عند C22، قوى ارتباط منخفضة بشكل ملحوظ، مما يبرز الدور الحاسم للهيكل الفراغي وموضع الاستبدال في تعديل تفاعلات الربط بين الليغاند والمستقبل.
تم أيضًا تقييم النشاط النسخي، حيث أظهرت النظائر 31 و34 و35 نشاطًا أعلى بشكل ملحوظ مقارنة بـ 1 نانومول من 1α،25(OH)₂D₃، بينما أظهرت النظائر 32 و33 و36-40 نشاطًا منخفضًا. أشارت النتائج إلى أن الفلورة السداسية عند C26 وC27 (31)، جنبًا إلى جنب مع 24،24-فلورة (34) و(23R)-فلورة (35)، عززت النشاط النسخي المعتمد على VDR-LBD. في المقابل، أدت (23S)-فلورة (36)، و23،23-ثنائي فلورة (37)، وC22-فلورة (38-40) إلى تقليل النشاط. كما أبرزت الدراسة أن AH-1 أظهر نشاط نسخي أعلى بـ 2.6 مرة من فيتامين D₃ الطبيعي، مع إظهار نظائر محددة (31 و34) نشاطًا أكبر. علاوة على ذلك، أظهرت جميع النظائر مقاومة متزايدة للأيض المعتمد على CYP24A1 مقارنة بالربط الطبيعي، مما يشير إلى أن الفلورة في مواضع محددة يمكن أن تعزز الاستقرار الأيضي. تم التخطيط لدراسات مستقبلية في الجسم الحي لاستكشاف الإمكانات العلاجية لهذه النظائر بشكل أكبر.
DOI: https://doi.org/10.1248/cpb.c25-00710
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41621952
Publication Date: 2026-01-29
Author(s): Fumihiro Kawagoe et al.
Primary Topic: Click Chemistry and Applications
Overview
In this research, twelve side-chain fluorinated analogs of 2α-[2-(tetrazol-2-yl)ethyl]-1α,25-dihydroxyvitamin D3 (AH-1) were designed and synthesized to evaluate their biological activities. The synthesis utilized a palladium-catalyzed Trost coupling reaction involving side-chain fluorinated CD-ring bromo-olefins and an A-ring enyne. Notably, some analogs, particularly C26,27-hexafluoro-AH-1 (31) and 24,24-difluoro-AH-1 (34), demonstrated significantly enhanced binding affinity to the human vitamin D receptor (hVDR), increased transcriptional activity in the VDR-ligand binding domain (VDR-LBD), and greater metabolic resistance to CYP24A1-mediated inactivation compared to the standard 1α,25(OH)2D3.
The study successfully synthesized these twelve analogs and assessed their biological properties, revealing that certain compounds exhibit superior activity profiles. While the focus was on the binding affinity to wild-type hVDR, the potential for these analogs to bind effectively to mutant VDRs linked to type II rickets was highlighted, given previous findings that AH-1 binds more strongly to the R274L mutant. Future research is planned to further investigate the activities of these analogs against mutant VDRs and to assess their in vivo effects in rat models of type II rickets and osteoporosis.
Introduction
The introduction of this research paper discusses the development and biological evaluation of 2α-substituted active vitamin D₃ analogs, specifically focusing on their enhanced binding affinity to the vitamin D receptor (VDR) and agonistic activity. Notably, analogs such as 2α-(3-hydroxypropoxy)-1α,25(OH)₂D₃ and 2α-(3-hydroxypropyl)-19-nor-1α,25(OH)₂D₃ have been shown to stabilize the hVDR-ligand binding domain by forming new hydrogen bonds and removing water molecules from the ligand complex. The compound 2α-[2-(tetrazol-2-yl)ethyl]-1α,25-dihydroxyvitamin D₃ (AH-1) demonstrated significant therapeutic effects in an ovariectomized rat model of osteoporosis, enhancing bone mineral density without inducing hypercalcemia, and exhibited a higher affinity for the mutated human VDR associated with hereditary vitamin D-dependent rickets type II.
Additionally, the paper highlights the synthesis of side-chain fluorinated vitamin D₃ analogs, which are designed to resist CYP24A1-dependent metabolism and modulate biological activities. One such analog, falecalcitriol, is currently used clinically for secondary hyperparathyroidism. The authors emphasize the importance of fluorinated side-chain modifications, which significantly influence the biological activity of 25-hydroxyvitamin D₃. The study presents a comprehensive synthesis of 12 novel side-chain fluoro-AH-1 analogs and their biological activities, aiming to elucidate the effects of fluorine atom positioning, number, and stereochemistry on VDR binding affinity and metabolic resistance.
Methods
In this study, various analytical techniques were employed to characterize the compounds synthesized. Proton ($^1$H) and carbon ($^{13}$C) nuclear magnetic resonance (NMR) spectra were recorded using JEOL AL-400 (400 MHz) and ECP-600 (600 MHz) spectrometers, with $^1$H-NMR referenced to tetramethylsilane (TMS) at δ 0.00 ppm or chloroform (CHCl$_3$) at δ 7.26 ppm, and $^{13}$C-NMR referenced to deuterated chloroform (CDCl$_3$) at δ 77.0 ppm. Infrared (IR) spectra were obtained using a JASCO FT-IR-800 spectrophotometer, while high-resolution mass spectrometry was performed on a SHIMADZU LCMS-IT-TOF mass spectrometer utilizing electrospray ionization (ESI).
Optical rotations were measured with a JASCO DIP-370 digital polarimeter, and column chromatography was conducted using silica gel 60N and silica gel 60 under anhydrous conditions in an argon atmosphere. Detailed $^1$H and $^{13}$C-NMR spectra for new compounds (29-40, 54-58, and 62-65) are provided in the Supplementary Materials.
Results
In this section, the authors detail the synthetic strategy employed to construct a series of vitamin D3 triene structures, as illustrated in Chart 1. The triene unit was synthesized using the palladium-catalyzed Trost coupling method, while the side-chain fragments (F-CD-ring) were prepared through previously established methods. The A-ring enyne moiety was derived from methyl α-D-glucopyranoside, and the synthesis of twelve 8-oxo-CD-rings commenced with these side-chain F-CD-rings. Notably, CD-ring 59 was utilized in the synthesis of 24,24-difluoro-1,3-cis-25-dihydroxy-19-norvitamin D3 derivatives.
The synthesized 8-oxo-CD-rings were subsequently converted into bromoolefins, which were then coupled with the A-ring precursor enyne using the Trost coupling reaction, yielding the desired vitamin D3 triene structures. However, the authors noted the formation of unknown by-products during the synthesis, leading to low yields for several final products, particularly compounds 31, 32, 36, and 40. High-performance liquid chromatography (HPLC) was employed to confirm the yields of selected compounds, underscoring the challenges faced in purification and product yield optimization.
Discussion
In this section, the biological evaluation of 12 synthetic fluoro-AH-1 analogs (29-40) was conducted, with 1α,25(OH)₂D₃ serving as a positive control. The binding affinity of these compounds for the human vitamin D receptor (hVDR) was assessed, revealing that analogs 29-35 demonstrated comparable or superior binding affinities relative to the natural ligand. Notably, the 24,24-difluoro and (23R)-fluoro analogs (34, 35) exhibited significantly enhanced binding affinities (224% and 205%, respectively), indicating that specific fluorine substitutions can substantially improve VDR affinity. Conversely, compounds 36-40, which featured fluorination at C23 in the (S)-configuration or at C22, showed markedly reduced binding affinities, underscoring the critical role of stereochemistry and substitution position in modulating ligand-receptor interactions.
Transcriptional activity was also evaluated, with analogs 31, 34, and 35 exhibiting significantly higher luciferase activity compared to 1 nM 1α,25(OH)₂D₃, while analogs 32, 33, and 36-40 displayed reduced activity. The results indicated that hexa-fluorination at C26 and C27 (31), along with 24,24-difluorination (34) and (23R)-fluorination (35), enhanced VDR-LBD-mediated transcriptional activity. In contrast, (23S)-fluorination (36), 23,23-difluorination (37), and C22-fluorination (38-40) diminished activity. The study also highlighted that AH-1 exhibited 2.6 times higher osteocalcin transcriptional activity than natural vitamin D₃, with specific analogs (31 and 34) showing even greater activity. Furthermore, all analogs demonstrated increased resistance to CYP24A1-dependent metabolism compared to the natural ligand, suggesting that fluorination at specific positions can enhance metabolic stability. Future in vivo studies are planned to further explore the therapeutic potential of these analogs.