DOI: https://doi.org/10.3389/fcimb.2024.1367385
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38628550
تاريخ النشر: 2024-04-02
المؤلف: Chaonan Wang وآخرون
الموضوع الرئيسي: صحة الحيوان وعلم المناعة
نظرة عامة
تركز الأبحاث على إسهال العجول حديثة الولادة (NCD)، وهو مرض شائع في العجول يؤثر بشكل كبير على صناعة الماشية بسبب الخسائر الاقتصادية والإنتاجية. تشمل العوامل المسببة الرئيسية لـ NCD فيروس الروتا البقري (BRV)، فيروس كورونا البقري (BCoV)، وإشريكية القولون المعوية السمية (ETEC) K99. غالبًا ما تكون طرق الكشف التقليدية عن هذه العوامل كثيفة العمل ومكلفة، مما دفع إلى تطوير اختبار PCR متعدد الخطوات في الوقت الحقيقي يهدف إلى الكشف المتزامن عن هذه العوامل.
قيمت الدراسة أداء اختبار PCR متعدد الخطوات في الوقت الحقيقي على 1,100 مسحة شرجية من العجول التي تظهر أعراض الإسهال، مقارنةً بفاعليته مع طرق RT-PCR التقليدية المعتمدة على الجل. أظهرت النتائج أن الاختبار يمكنه تحديد العوامل المستهدفة بشكل خاص دون تفاعل متبادل، محققًا حد كشف يبلغ حوالي 1 نسخة/µL للعوامل الفردية و10 نسخ/µL في الشكل المتعدد. أظهر طريقة PCR في الوقت الحقيقي حساسية وسرعة فائقة في تمييز العوامل، مع الحفاظ على التناسق مع الطرق المعتمدة على الجل. أشارت بيانات المراقبة إلى أن BRV وBCoV هما مساهمان رئيسيان في إسهال العجول في الصين. بشكل عام، يظهر الاختبار المطور خصوصية وحساسية وقوة عالية، مما يجعله أداة قيمة للتشخيص السريري والبحث في إسهال العجول.
مقدمة
تتناول مقدمة ورقة البحث التأثير الكبير لإسهال العجول حديثة الولادة (NCD) على وفيات ومراضة العجول، مع الإبلاغ عن خطر الوفاة بحوالي 5% خلال أول 30 يومًا بعد الولادة. يحدث NCD بشكل أساسي بسبب العدوى من عوامل مسببة مختلفة، لا سيما فيروس الروتا البقري (BRV)، فيروس كورونا البقري (BCoV)، وإشريكية القولون المعوية السمية K99 (ETEC). يُعرف BRV، وهو فيروس RNA مزدوج الشريط غير مغلف، بأنه السبب الفيروسي الرئيسي للإسهال في العجول حديثة الولادة، بينما يُعتبر BCoV، وهو فيروس RNA مفرد الشريط إيجابي الاتجاه، متورطًا أيضًا بشكل متكرر في حالات الإسهال الفيروسي ويمكن أن يؤدي إلى أمراض تنفسية في العجول.
تتطلب تعقيدات NCD، التي غالبًا ما تنتج عن عدوى مختلطة، طرق تشخيص سريعة وحساسة للإدارة الفعالة. تفتقر تقنيات الكشف التقليدية، مثل عزل الفيروس وELISA، إلى الفعالية، مما دفع إلى تطوير اختبارات PCR في الوقت الحقيقي الفردية والمتعددة للكشف عن العوامل المسببة. ومع ذلك، فإن الطرق المتعددة الحالية لا تكشف في الوقت نفسه عن BRV وBCoV وE. coli K99+. تقدم هذه الدراسة اختبار PCR متعدد الخطوات في الوقت الحقيقي جديد يستخدم تقنية TaqMan، مصمم للتشخيص السريع والحساس لهذه العوامل الثلاثة في العينات السريرية. تم التحقق من أداء الاختبار بدقة، مما يدل على إمكانيته في الدراسات التشخيصية والمراقبة والوبائية المتعلقة بـ NCD.
طرق
يستعرض قسم “المواد والطرق” تصميم التجربة والإجراءات المستخدمة في الدراسة. يوضح المواد المحددة المستخدمة، بما في ذلك أي مواد كيميائية أو أدوات أو تقنيات، ويصف البروتوكولات المتبعة لضمان إمكانية التكرار. قد يتضمن القسم أيضًا معلومات حول إعداد العينات، تقنيات جمع البيانات، والتحليلات الإحصائية المطبقة لتفسير النتائج.
بالإضافة إلى ذلك، تم تصميم الطرق لمعالجة الأسئلة البحثية المطروحة في الدراسة، مما يضمن أن الأساليب المختارة مناسبة للفرضيات التي يتم اختبارها. هذا القسم حاسم للتحقق من النتائج والسماح للباحثين الآخرين بتكرار الدراسة في ظروف مماثلة.
نتائج
في قسم النتائج، تحدد الدراسة أكثر القطاعات الجينومية المحفوظة لتصميم البرايمرات والمجسات لاختبار PCR في الوقت الحقيقي المستهدف لفيروس الروتا البقري (BRV)، فيروس كورونا البقري (BcoV)، وإشريكية القولون K99+. بشكل محدد، وُجد أن القطاع 11 من جينوم BRV، الذي يشفر بروتين NSP5، هو الأكثر حفظًا، مما أدى إلى اختيار قطعة بطول 130 قاعدة (من 216 قاعدة إلى 346 قاعدة) كهدف. بالنسبة لـ BcoV، تم اختيار جين N بسبب حفظه، مع تصميم البرايمرات لقطعة بطول 115 قاعدة تمتد عبر القواعد 476-590. بالإضافة إلى ذلك، بالنسبة لإشريكية القولون K99+، تم اختيار المنطقة المحفوظة من 210-345 قاعدة من جين البيلوس.
من المتوقع أن تكشف البرايمرات والمجسات المصممة، المفصلة في الجدول 1، عن جميع السلالات السائدة من BRV وBcoV وE. coli K99+ في القطيع. لتسهيل التحليل الكمي، تم استنساخ كل قطعة أمبليكون في متجه pMD18-T لإنشاء بلازميدات قياسية لإنشاء منحنى قياسي في التجارب اللاحقة.
مناقشة
في هذه الدراسة، تم تطوير اختبار PCR متعدد الخطوات في الوقت الحقيقي للكشف المتزامن عن فيروس الروتا البقري (BRV)، فيروس كورونا البقري (BCoV)، وإشريكية القولون المعوية السمية K99+ في عينات سريرية من الماشية. تم تحسين الاختبار باستخدام تسلسلات من 40 عزل سريري من BRV، 41 من BCoV، و18 من E. coli K99+، مع تصميم البرايمرات والمجسات لاستهداف المناطق المحفوظة للغاية من الجينات المعنية. تم تحديد حساسية الاختبار لتكون منخفضة تصل إلى 1 نسخة/μL للكشف الفردي و10 نسخ/μL للكشف المتعدد، مما يدل على تحسين كبير مقارنة بالطرق السابقة. أظهر الاختبار خصوصية عالية، مع عدم وجود تفاعل متبادل مع عوامل مسببة أخرى تم اختبارها.
شملت التطبيقات السريرية للاختبار المتعدد تحليل 1,100 مسحة شرجية من العجول التي تظهر إسهالًا عبر عدة مقاطعات في الصين. أشارت النتائج إلى انتشار BRV وBCoV يتجاوز 20% في عدة مناطق، بينما كانت نسبة الكشف عن E. coli K99+ أقل بشكل ملحوظ، ربما بسبب العلاج بالمضادات الحيوية السابق. كانت العدوى المشتركة شائعة، خاصة بين BRV وBCoV. تفوق اختبار PCR المتعدد على RT-PCR التقليدي المعتمد على الجل في الحساسية، مما يؤكد فائدته كأداة تشخيصية موثوقة لتحديد العوامل المسببة لإسهال العجول حديثة الولادة (NCD). تؤكد النتائج على الحاجة إلى المراقبة المستمرة وتطوير لقاحات فعالة ضد BRV وBCoV في الصين.
DOI: https://doi.org/10.3389/fcimb.2024.1367385
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38628550
Publication Date: 2024-04-02
Author(s): Chaonan Wang et al.
Primary Topic: Animal health and immunology
Overview
The research focuses on neonatal calf diarrhea (NCD), a prevalent disease in calves that significantly impacts the bovine industry due to economic and productivity losses. The primary pathogens responsible for NCD include bovine rotavirus (BRV), bovine coronavirus (BCoV), and Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) K99. Traditional detection methods for these pathogens are often labor-intensive and costly, prompting the development of a one-step multiplex Real-Time PCR assay aimed at simultaneous detection of these agents.
The study evaluated the performance of the multiplex Real-Time PCR assay on 1,100 rectal swabs from calves exhibiting diarrhea symptoms, comparing its efficacy to conventional gel-based RT-PCR methods. The results demonstrated that the assay could specifically identify the target pathogens without cross-reactivity, achieving a detection limit of approximately 1 copy/µL for individual pathogens and 10 copies/µL in multiplex format. The real-time PCR method exhibited superior sensitivity and rapidity in distinguishing the pathogens, while maintaining consistency with gel-based methods. Surveillance data indicated that BRV and BCoV are significant contributors to calf diarrhea in China. Overall, the developed assay shows high specificity, sensitivity, and robustness, making it a valuable tool for clinical diagnostics and research on calf diarrhea.
Introduction
The introduction of the research paper addresses the significant impact of neonatal calf diarrhea (NCD) on calf mortality and morbidity, with a reported case fatality risk of approximately 5% within the first 30 days post-birth. NCD is primarily caused by infections from various pathogens, notably bovine rotavirus (BRV), bovine coronavirus (BCoV), and enterotoxigenic Escherichia coli K99 (ETEC). BRV, a non-enveloped double-stranded RNA virus, is identified as the leading viral cause of diarrhea in newborn calves, while BCoV, a single-stranded positive-sense RNA virus, is also frequently implicated in cases of viral diarrhea and can lead to respiratory illnesses in calves.
The complexity of NCD, often resulting from mixed infections, necessitates rapid and sensitive diagnostic methods for effective management. Traditional detection techniques, such as virus isolation and ELISA, have limitations, prompting the development of single and multiplex real-time PCR assays for pathogen detection. However, existing multiplex methods do not simultaneously detect BRV, BCoV, and E. coli K99+. This study introduces a novel multiplex real-time PCR assay utilizing TaqMan technology, designed for the rapid and sensitive diagnosis of these three pathogens in clinical samples. The assay’s performance was rigorously validated, demonstrating its potential utility in diagnostic, surveillance, and epidemiological studies related to NCD.
Methods
The “Materials and Methods” section outlines the experimental design and procedures employed in the study. It details the specific materials used, including any reagents, instruments, or technologies, and describes the protocols followed to ensure reproducibility. The section may also include information on sample preparation, data collection techniques, and statistical analyses applied to interpret the results.
Additionally, the methods are designed to address the research questions posed in the study, ensuring that the chosen approaches are appropriate for the hypotheses being tested. This section is crucial for validating the findings and allowing other researchers to replicate the study under similar conditions.
Results
In the results section, the study identifies the most conserved genomic segments for designing primers and probes for real-time PCR targeting Bovine Rotavirus (BRV), Bovine Coronavirus (BcoV), and E. coli K99 +. Specifically, segment 11 of the BRV genome, which encodes the NSP5 protein, was found to be the most conserved, leading to the selection of a 130 bp fragment (from 216 bp to 346 bp) as the target. For BcoV, the N gene was chosen due to its conservation, with primers designed for a 115 bp fragment spanning bases 476-590. Additionally, for E. coli K99 +, the conserved region from 210-345 bases of the pilis gene was selected.
The designed primers and probes, detailed in Table 1, are expected to effectively detect all prevalent strains of BRV, BcoV, and E. coli K99 + in the herd. To facilitate quantitative analysis, each amplicon fragment was cloned into the pMD18-T vector to create standard plasmids for establishing a standard curve in subsequent experiments.
Discussion
In this study, a multiplex real-time PCR assay was developed for the simultaneous detection of Bovine Rotavirus (BRV), Bovine Coronavirus (BCoV), and enterotoxigenic E. coli K99+ in clinical samples from cattle. The assay was optimized using sequences from 40 clinical isolates of BRV, 41 of BCoV, and 18 of E. coli K99+, with primers and probes designed to target highly conserved regions of the respective genes. The sensitivity of the assay was determined to be as low as 1 copy/μL for single detections and 10 copies/μL for multiplex detection, demonstrating a significant improvement over previous methods. The assay showed high specificity, with no cross-reactivity observed with other pathogens tested.
Clinical application of the multiplex assay involved analyzing 1,100 rectal swabs from calves exhibiting diarrhea across multiple provinces in China. The results indicated a prevalence of BRV and BCoV exceeding 20% in several regions, while the detection rate for E. coli K99+ was notably lower, potentially due to prior antibiotic treatment. Co-infections were common, particularly between BRV and BCoV. The multiplex PCR assay outperformed conventional gel-based RT-PCR in sensitivity, confirming its utility as a reliable diagnostic tool for identifying the etiological agents of neonatal calf diarrhea (NCD). The findings underscore the need for ongoing surveillance and the development of effective vaccines against BRV and BCoV in China.