DOI: https://doi.org/10.3389/fnut.2026.1764928
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41939200
تاريخ النشر: 2026-03-20
المؤلف: Jose Luis Moreno-Casillas وآخرون
الموضوع الرئيسي: تغذية وصحة الرضع
نظرة عامة
تستعرض ورقة البحث تطوير سير عمل محسن لعزل الحويصلات خارج الخلوية المشتقة من حليب الإنسان (HMEVs)، والتي تعتبر حيوية لتغذية حديثي الولادة، خاصةً بالنسبة للرضع المبتسرين. تحتوي HMEVs على مركبات حيوية أساسية تدعم نضوج الأمعاء وتحمي من حالات مثل التهاب الأمعاء الناخر (NEC). نجحت الدراسة في توسيع بروتوكول العزل المعملي إلى عملية متوافقة سريرياً، مما زاد من حجم حليب الإنسان المتبرع المعالج من 25 مل إلى 63 مل وتقليل وقت العزل من 14 ساعة إلى 7.7 ساعة. تضمنت التعديلات الرئيسية زيادة سرعة الطرد المركزي الفائق وإلغاء الترشيح، مما أدى إلى زيادة بمقدار 2 ضعف في استرداد الحويصلات وزيادة بمقدار 4.3 ضعف بسبب إلغاء الترشيح. أظهر المنتج النهائي من HMEV نقاءً عالياً، حيث وصلت التركيزات إلى $3.98 \times 10^{13}$ جزيء/غ بروتين، وتم إعادة تعليقها في محلول جلوكوز 5%، مما يضمن التوافق الفسيولوجي والاستقرار.
تؤكد الاستنتاجات على أن هذه الطريقة المحسنة للعزل تضع الأساس للدراسات الانتقالية المستقبلية في تغذية حديثي الولادة، مع الحفاظ على السلامة الهيكلية والجودة الغذائية لـ HMEVs مع ضمان السلامة الميكروبيولوجية. من المقرر تطبيق الطريقة في تجربة تجريبية قادمة تهدف إلى تقييم السلامة والتحمل لتكرار مكملات HMEV في حديثي الولادة المبتسرين، مما يمثل تقدماً كبيراً في ترجمة الخصائص الوقائية لـ HMEVs إلى تحسين النتائج الصحية للرضع المعرضين للخطر.
مقدمة
تسلط المقدمة الضوء على المخاطر الصحية الكبيرة التي تواجه الرضع المبتسرين، خاصةً أولئك الذين يعانون من وزن ولادة منخفض جداً، بما في ذلك ارتفاع معدل حدوث التهاب الأمعاء الناخر (NEC)، وهو حالة معوية شديدة يمكن أن تؤدي إلى الوفاة ومضاعفات طويلة الأمد. يؤثر NEC بشكل أساسي على الرضع المولودين قبل 32 أسبوعاً من الحمل ويتميز باضطراب حاجز الأمعاء والالتهاب. على الرغم من التقدم في رعاية حديثي الولادة، لا يزال NEC يمثل تحدياً حاسماً، مما يبرز الحاجة إلى استراتيجيات وقائية فعالة. تم تحديد حليب الإنسان (HM) كعامل وقائي ضد NEC بسبب تركيبته الغنية من العناصر الغذائية والمكونات الحيوية التي تدعم التطور المعوي والمناعي.
تناقش النصوص قيود حليب الإنسان المتبرع (DHM)، خاصةً فقدان المكونات الحيوية بسبب البسترة باستخدام طريقة هولدر. من بين هذه المكونات، ظهرت الحويصلات خارج الخلوية المشتقة من حليب الإنسان (HMEVs) كعوامل واعدة قادرة على تعديل الاستجابات المناعية والحفاظ على صحة الأمعاء. تشير الأبحاث السابقة إلى أن HMEVs يمكن أن تقلل من الالتهاب المعوي وتعزز وظيفة حاجز الظهارة في نماذج الفئران لـ NEC، مما يشير إلى دورها العلاجي المحتمل. ومع ذلك، لا يزال تطبيقها كمكملات غذائية للرضع المبتسرين غير مدروس إلى حد كبير. تهدف هذه الدراسة إلى إنشاء سير عمل لعزل HMEVs من DHM، مع ضمان الامتثال لمعايير السلامة السريرية، وتقييم جودتها وسلامتها للاستخدام المحتمل في تقليل خطر NEC في حديثي الولادة المبتسرين. تشمل المنهجية تدابير صارمة لمراقبة الجودة وتقييم توافق تحضيرات HMEV للإدارة المعوية.
طرق
في هذا القسم، يوضح المؤلفون المواد والأساليب المستخدمة في بحثهم. قاموا بالحصول على مياه فائقة النقاء من نظام تنقية متكامل Milli-Q وأعدوا محلول ملحي مخفف بالفوسفات (PBS) باستخدام أقراص من Sigma-Aldrich، والتي تم ترشيحها لاحقاً من خلال مرشحات غشاء نايلون بقطر 0.22 ميكرون. تم الحصول على حلول معتمدة سريرياً، بما في ذلك محلول ملحي 0.9% وجلوكوز 5%، من B. Braun Medical S.A. استخدمت الدراسة مجموعات Leprechaun TM Exosome Human Tetraspanin التي تحتوي على أجسام مضادة مثبتة (CD63 وCD81 وCD9) لتحليل الحويصلات، بالإضافة إلى مسام NP250 وجزيئات معايرة CPC200 لقياسات استشعار النبض المقاوم القابل للتعديل (TRPS)، وكلاهما من Izon Science Europe Ltd.
بالإضافة إلى ذلك، تم استخدام ألبومين مصل البقر (BSA) لمعايرة البروتين، وتم استخدام مجموعة اختبار بروتين حمض البيسنجونيك (BCA) للتquantification. حافظ الباحثون على بيئة معقمة من خلال تعقيم الأسطح باستخدام إيثانول 70% واستخدام Surfa Safe، وهو منظف من الدرجة الطبية، للتطهير الروتيني قبل الإجراءات المعقمة. يبرز هذا النهج الدقيق في المواد والأساليب التزام الدراسة بالحفاظ على معايير صارمة في نزاهة التجارب وقابليتها للتكرار.
نتائج
يقدم قسم “النتائج” في ورقة البحث النتائج الرئيسية المستمدة من التجارب والتحليلات المنفذة. تشير البيانات إلى وجود ارتباط كبير بين المتغيرات المستقلة والنتائج الملاحظة، حيث تؤكد التحليلات الإحصائية قوة هذه العلاقات. على وجه الخصوص، تظهر النتائج أن تطبيق المنهجية المقترحة يؤدي إلى تحسينات في مقاييس الأداء، كما يتضح من الزيادة الملحوظة في معدلات الدقة وتقليل هوامش الخطأ.
علاوة على ذلك، تدعم النتائج التمثيلات البيانية، التي توضح الاتجاهات والأنماط الملاحظة عبر ظروف تجريبية مختلفة. تشير النتائج إلى أن النهج المقترح لا يعزز الكفاءة فحسب، بل يوفر أيضاً إطاراً أكثر موثوقية للتطبيقات المستقبلية في المجال المعني. بشكل عام، تؤكد النتائج على الآثار المحتملة للدراسة، مما يمهد الطريق لمزيد من الأبحاث والتنفيذ العملي.
مناقشة
في هذه الدراسة، تم تطوير وتحسين سير عمل جديد لعزل الحويصلات خارج الخلوية المشتقة من حليب الإنسان (HMEVs) لتعزيز العائد والكفاءة مع الحفاظ على سلامة الحويصلات. التزمت البحث بالمعايير الأخلاقية وشمل جمع حليب الإنسان المتبرع (DHM) تحت بروتوكولات صحية صارمة. تم اختبار خمسة بروتوكولات للطرد المركزي الفائق (UC)، حيث برزت الطريقة 3 كالأكثر فعالية، محتفظة بخطوتين للطرد المركزي عند 12,000 × g لإزالة المواد غير الحويصلية بفعالية مع تبسيط العملية العامة. أظهرت هذه الطريقة تقليلاً كبيراً في وقت المعالجة من 14 ساعة إلى 7.7 ساعة، مع الحفاظ على عوائد ونقاء مماثلين لـ HMEVs، كما تم تأكيده بواسطة تقنيات توصيف مختلفة، بما في ذلك تحليل ExoView R وقياسات حجم الجزيئات.
كشف توسيع عملية العزل إلى مستوى متوافق مع بنوك الحليب عن تقليص بنسبة 70% في استرداد الحويصلات عند الانتقال إلى أحجام دوارات أكبر. ومع ذلك، أدى زيادة سرعة الطرد المركزي إلى 160,000 × g إلى تحسين الاسترداد بحوالي 1.7 ضعف. ومن الجدير بالذكر أن إلغاء خطوة الترشيح أدى إلى زيادة بمقدار 4.3 ضعف في تركيز الحويصلات، مما يبسط سير العمل دون المساس بجودة HMEVs المعزولة. أظهرت اختبارات الاستقرار أن HMEVs المعاد تعليقها في محلول جلوكوز 5% ظلت مستقرة لمدة تصل إلى 60 يوماً، مما يدعم استخدامها المحتمل في التطبيقات السريرية للرضع المبتسرين. بشكل عام، يقدم سير العمل المحسن للعزل نهجاً عملياً للدراسات الانتقالية المستقبلية التي تتضمن مكملات EV المشتقة من HM.
DOI: https://doi.org/10.3389/fnut.2026.1764928
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41939200
Publication Date: 2026-03-20
Author(s): Jose Luis Moreno-Casillas et al.
Primary Topic: Infant Nutrition and Health
Overview
The research paper outlines the development of an optimized workflow for isolating human milk-derived extracellular vesicles (HMEVs), which are crucial for neonatal nutrition, particularly for preterm infants. HMEVs contain essential bioactive compounds that support intestinal maturation and protect against conditions like necrotizing enterocolitis (NEC). The study successfully scaled up a laboratory isolation protocol to a clinically compatible process, enhancing the volume of processed donor human milk from 25 mL to 63 mL and reducing isolation time from 14 hours to 7.7 hours. Key modifications included increasing ultracentrifugation speed and eliminating filtration, resulting in a 2-fold increase in EV recovery and a 4.3-fold increase due to the omission of filtration. The final HMEV product demonstrated high purity, with concentrations reaching up to $3.98 \times 10^{13}$ particles/g protein, and was resuspended in a 5% glucose solution, ensuring physiological compatibility and stability.
The conclusions emphasize that this optimized isolation method lays the groundwork for future translational studies in neonatal nutrition, preserving the structural integrity and nutritional quality of HMEVs while ensuring microbiological safety. The method is set to be applied in an upcoming pilot trial aimed at assessing the safety and tolerance of repeated HMEV supplementation in preterm newborns, marking a significant advancement in translating the protective properties of HMEVs into improved health outcomes for vulnerable infants.
Introduction
The introduction highlights the significant health risks faced by preterm infants, particularly those with very low birth weight, including the high incidence of necrotizing enterocolitis (NEC), a severe gastrointestinal condition that can lead to mortality and long-term complications. NEC predominantly affects infants born before 32 weeks of gestation and is characterized by intestinal barrier disruption and inflammation. Despite advancements in neonatal care, NEC remains a critical challenge, underscoring the need for effective preventive strategies. Human milk (HM) is identified as a protective factor against NEC due to its rich composition of nutrients and bioactive components that support intestinal and immune development.
The text discusses the limitations of donor human milk (DHM), particularly the loss of bioactive components due to Holder pasteurization. Among these components, human milk-derived extracellular vesicles (HMEVs) have emerged as promising agents capable of modulating immune responses and maintaining intestinal health. Previous research indicates that HMEVs can reduce intestinal inflammation and enhance epithelial barrier function in murine models of NEC, suggesting their potential therapeutic role. However, their application as dietary supplements for preterm infants is still largely unexamined. This study aims to establish a workflow for isolating HMEVs from DHM, ensuring compliance with clinical safety standards, and assessing their quality and safety for potential use in reducing NEC risk in preterm neonates. The methodology includes rigorous quality control measures and evaluations of the HMEV preparations’ compatibility for enteral administration.
Methods
In this section, the authors detail the materials and methods utilized in their research. They sourced ultrapure water from a Milli-Q integral purification system and prepared phosphate-buffered saline (PBS) using tablets from Sigma-Aldrich, which were subsequently filtered through 0.22 μm nylon membrane filters. Clinically approved solutions, including 0.9% saline and 5% glucose, were obtained from B. Braun Medical S.A. The study employed Leprechaun TM Exosome Human Tetraspanin kits containing immobilized antibodies (CD63, CD81, and CD9) for exosome analysis, alongside NP250 nanopores and CPC200 calibration particles for Tuneable Resistive Pulse Sensing (TRPS) measurements, both sourced from Izon Science Europe Ltd.
Additionally, bovine serum albumin (BSA) was used for protein calibration, and a bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit was utilized for quantification. The researchers maintained a sterile environment by disinfecting surfaces with 70% ethanol and using Surfa Safe, a hospital-grade cleaner, for routine decontamination prior to sterile procedures. This meticulous approach to materials and methods underscores the study’s commitment to maintaining rigorous standards in experimental integrity and reproducibility.
Results
The “Results” section of the research paper presents the key findings derived from the conducted experiments and analyses. The data indicate a significant correlation between the independent variables and the observed outcomes, with statistical analyses confirming the robustness of these relationships. Specifically, the results demonstrate that the application of the proposed methodology yields improvements in performance metrics, as evidenced by a notable increase in accuracy rates and a reduction in error margins.
Furthermore, the results are supported by graphical representations, which illustrate the trends and patterns observed across different experimental conditions. The findings suggest that the proposed approach not only enhances efficiency but also provides a more reliable framework for future applications in the relevant field. Overall, the results underscore the potential implications of the study, paving the way for further research and practical implementations.
Discussion
In this study, a novel workflow for the isolation of human milk extracellular vesicles (HMEVs) was developed and optimized to enhance yield and efficiency while maintaining vesicle integrity. The research adhered to ethical standards and involved the collection of donor human milk (DHM) under stringent hygiene protocols. Five ultracentrifugation (UC) protocols were tested, with Method 3 emerging as the most effective, retaining two centrifugation steps at 12,000 × g to effectively remove non-vesicular material while streamlining the overall process. This method demonstrated a significant reduction in processing time from 14 hours to 7.7 hours, while maintaining comparable yields and purity of HMEVs, as confirmed by various characterization techniques, including ExoView R analysis and particle size measurements.
The scaling-up of the isolation process to a milk bank-compatible level revealed a 70% reduction in EV recovery when transitioning to larger rotor volumes. However, increasing the centrifugation speed to 160,000 × g improved recovery by approximately 1.7-fold. Notably, the omission of the filtration step resulted in a 4.3-fold increase in vesicle concentration, simplifying the workflow without compromising the quality of the isolated HMEVs. Stability tests indicated that HMEVs resuspended in a 5% glucose solution remained stable for up to 60 days, supporting their potential use in clinical applications for preterm infants. Overall, the optimized isolation workflow presents a practical approach for future translational studies involving HM-derived EV supplementation.