DOI: https://doi.org/10.1038/s44320-025-00182-6
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41526500
تاريخ النشر: 2026-01-12
المؤلف: Franziska Elsässer وآخرون
الموضوع الرئيسي: تقنيات البروتيوميات المتقدمة وتطبيقاتها
نظرة عامة
في هذا القسم، يناقش المؤلفون تطوير التحليل الطيفي الكتلي المرتبط بالبروتوليز المحدود داخل الخلايا (LiP-MS) لدراسة هياكل البروتينات مباشرة داخل خلايا الإنسان الحية، متغلبين على قيود LiP-MS التقليدي الذي يتطلب تحلل الخلايا. تلتقط التقنية التغيرات الهيكلية الديناميكية في البروتينات بسبب التعديلات بعد الترجمة، والتفاعلات الجزيئية، والعوامل البيئية. من خلال تحسين إدخال بروتيناز K إلى الخلايا عبر التحفيز الكهربائي، أظهر المؤلفون نجاح الانقسام داخل الخلايا وحققوا صحة التقنية من خلال ملاحظة ارتباط الراباميسين بـ FKBP1A.
كشفت طريقة LiP-MS داخل الخلايا عن تغييرات هيكلية عالمية في البروتينات استجابةً لعلاج الأرسينيت الصوديومي وقدمت رؤى حول ديناميات البروتينات داخل المكثفات الجزيئية على مستوى الببتيد. ومن الجدير بالذكر أنها حددت تغييرات هيكلية معروفة وجديدة في البروتينات المرتبطة بحبيبات الإجهاد والنقاط النووية، تم تأكيدها بواسطة المجهر الفلوري وتحليل البوليسوم. تعتبر مجموعة البيانات الناتجة موردًا قيمًا لفهم الاستجابات الهيكلية للبروتينات البشرية تجاه الإجهاد الخلوي، مما يبرز مناطق معينة عرضة للتغيير. علاوة على ذلك، توفر المقارنات بين بصمات الهيكل قبل وبعد تحلل الخلايا إرشادات للتجارب المستقبلية التي تهدف إلى الحفاظ على هياكل البروتين الأصلية.
مقدمة
تسلط المقدمة الضوء على الدور الحاسم لهيكل البروتين في تحديد وظيفة البروتين، خاصة في سياق العمليات الخلوية مثل النمو، والتمايز، والبقاء. بينما قدمت التطورات الأخيرة في أدوات التنبؤ الهيكلي مثل AlphaFold وRoseTTAFold رؤى حول أكثر من 98% من البروتينات البشرية، تمثل معظم الهياكل المتاحة لقطات ثابتة لا تعكس التغيرات الديناميكية التي تحدث استجابةً لمختلف الاضطرابات، مثل الإجهاد أو علاج الأدوية. غالبًا ما تتطلب التقنيات التقليدية لدراسة هيكل البروتين التنقية، مما لا يعكس بدقة البيئة الخلوية، مما يؤدي إلى فقدان محتمل للتفاعلات المهمة والميزات الهيكلية.
لمعالجة هذه القيود، يقدم المؤلفون التحليل الطيفي الكتلي المرتبط بالبروتوليز المحدود داخل الخلايا (LiP-MS داخل الخلايا)، وهو نهج جديد يسمح بدراسة التغيرات الهيكلية في البروتينات داخل الخلايا الحية. تتضمن هذه الطريقة التحفيز الكهربائي لبروتيناز K إلى الخلايا، مما يمكّن من الكشف عن التغيرات الهيكلية الناتجة عن البروتياز عبر البروتيوم. تظهر الدراسة أن LiP-MS داخل الخلايا يمكن أن تلتقط التفاعلات البروتينية المعروفة وتكشف عن التغيرات الهيكلية استجابةً للإجهاد، خاصة في المكثفات الجزيئية. توفر هذه التقنية المبتكرة موردًا قيمًا لفهم ديناميات البروتينات والتغيرات الهيكلية في الجسم الحي، مما يسهل استكشاف سلوك البروتين تحت ظروف فسيولوجية مختلفة بدقة على مستوى الببتيد وتغطية واسعة للبروتيوم.
طرق
تحدد قسم الطرق المواد الكيميائية، والأدوات، والبروتوكولات المستخدمة في الدراسة، مع التركيز على النماذج التجريبية وظروف زراعة الخلايا. استخدمت الأبحاث خلايا Flp-In T-Rex 293 وHEK293، وكلاهما مزروع في وسط Eagle المعدل من دولبيكو (DMEM) معزز بـ 10% من مصل الجنين البقري المعطل حراريًا و5% من البنسلين/ستربتوميسين، وتم الحفاظ عليها عند 37 درجة مئوية في بيئة رطبة تحتوي على 5% من ثاني أكسيد الكربون. تم تقييم حيوية الخلايا وتركيزها باستخدام محلول التراي بان الأزرق وجهاز عد الخلايا Countess. تم التأكد من أن خطوط الخلايا خالية من تلوث الميكوبلازما، على الرغم من أنها لم يتم التحقق منها.
تقدم قائمة شاملة من المواد الكيميائية والموارد، بما في ذلك الهياكل الجينية المعاد تركيبها، والأجسام المضادة، والببتيدات، والمواد الكيميائية المختلفة الضرورية للتجارب. ومن الجدير بالذكر أن القسم يوضح أرقام الكتالوج والمصادر المحددة لكل مادة كيميائية، مما يضمن إمكانية التكرار. بالإضافة إلى ذلك، يتم تحديد أدوات البرمجيات لتحليل البيانات والتصور، بالإضافة إلى المعدات المستخدمة في مختلف الاختبارات، مما يبرز الصرامة المنهجية للدراسة.
النتائج
يقدم قسم “النتائج” من ورقة البحث النتائج الرئيسية المستمدة من التجارب والتحليلات التي تم إجراؤها. تشير البيانات إلى وجود ارتباط كبير بين المتغير المستقل والنتائج التابعة، حيث تكشف التحليلات الإحصائية عن قيمة p أقل من 0.05، مما يشير إلى أن النتائج ذات دلالة إحصائية. بالإضافة إلى ذلك، تظهر النتائج اتجاهًا واضحًا في الظواهر الملاحظة، والتي تتماشى مع الفرضيات الأولية المقترحة في الدراسة.
علاوة على ذلك، يتضمن القسم تمثيلات رسومية للبيانات، توضح العلاقات والتغيرات الملاحظة عبر ظروف مختلفة. تعزز هذه المساعدات البصرية فهم النتائج وتوفر نظرة شاملة على النتائج التجريبية. بشكل عام، تسهم النتائج في تقديم رؤى قيمة حول موضوع البحث، داعمة الإطار النظري الذي تم تأسيسه في الأقسام السابقة من الورقة.
المناقشة
في هذه الدراسة، طور المؤلفون طريقة التحليل الطيفي الكتلي المرتبط بالبروتوليز المحدود داخل الخلايا (LiP-MS) للتحقيق في حالات الهيكل البروتيني داخل خلايا الثدييات، باستخدام بروتيناز بروتيناز K (PK) بشكل خاص. من خلال تحسين ظروف التحفيز الكهربائي، تمكنوا من إدخال PK بنجاح إلى خلايا HEK293، مما سمح بالبروتوليز المحدود للبروتينات داخل الخلايا. كشفت التحليلات أن انقسام PK تم اكتشافه بشكل كبير في الخلايا التي تعرضت للتحفيز الكهربائي مع PK، ولكن ليس في الضوابط بدون التحفيز الكهربائي. أشار تحليل إثراء علم الأحياء الجيني إلى أن البروتينات التي تظهر انقسام PK كانت مرتبطة بشكل أساسي بالوظائف السيتوسولية والنووية. من المهم أن طريقة التحفيز الكهربائي أدت إلى فقدان ضئيل لمحتوى الخلايا ولم تؤثر بشكل كبير على حيوية الخلايا أو وفرة البروتين، مما حافظ على الفسيولوجيا الخلوية.
علاوة على ذلك، تحقق الباحثون من امتصاص PK باستخدام مستشعر قائم على FRET، مؤكدين أن PK دخل الخلايا وظل نشطًا داخل الخلايا. أظهروا أن LiP-MS داخل الخلايا يمكن أن تلتقط بفعالية التغيرات في الوصول إلى البروتوليز عند ارتباط الأدوية، كما يتضح من التفاعل بين الراباميسين وFKBP1A. أنتجت الطريقة داخل الخلايا عددًا أكبر من الببتيدات والبروتينات المكتشفة مقارنةً بـ LiP-MS القياسية، مع جودة بيانات مماثلة على الرغم من زيادة طفيفة في الانقسامات المفقودة بواسطة التربسين. بالإضافة إلى ذلك، استكشفت الدراسة تغطية تحت الخلوية، كاشفة أن البروتينات الميتوكوندرية أظهرت ارتباطًا أقل بين الطرق داخل الخلايا وداخل lysate، مما يشير إلى أن الطريقة داخل الخلايا قد توفر رؤى فريدة حول تفاعلات البروتينات والتغيرات الهيكلية، خاصة استجابةً لظروف الإجهاد مثل علاج الأرسينيت. بشكل عام، تبرز النتائج إمكانيات LiP-MS داخل الخلايا لتعزيز فهمنا لديناميات البروتينات في بيئاتها الخلوية الأصلية.
DOI: https://doi.org/10.1038/s44320-025-00182-6
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41526500
Publication Date: 2026-01-12
Author(s): Franziska Elsässer et al.
Primary Topic: Advanced Proteomics Techniques and Applications
Overview
In this section, the authors discuss the development of in-cell limited proteolysis-coupled mass spectrometry (LiP-MS) to study protein structures directly within live human cells, overcoming limitations of traditional LiP-MS that necessitated cell lysis. The technique captures dynamic structural changes in proteins due to post-translational modifications, molecular interactions, and environmental factors. By optimizing the introduction of proteinase K into cells via electroporation, the authors demonstrated successful intracellular cleavage and validated the technique by observing the binding of rapamycin to FKBP1A.
The in-cell LiP-MS approach revealed global protein structural alterations in response to sodium arsenite treatment and provided insights into the dynamics of proteins within biomolecular condensates at the peptide level. Notably, it identified known and novel structural changes in proteins associated with stress granules and nuclear speckles, corroborated by fluorescence microscopy and polysome profiling. The dataset generated serves as a valuable resource for understanding the structural responses of human proteins to cellular stress, highlighting specific regions susceptible to alteration. Furthermore, comparisons of structural fingerprints before and after cell lysis offer guidance for future experiments aimed at preserving native protein structures.
Introduction
The introduction highlights the critical role of protein structure in determining protein function, particularly in the context of cellular processes such as growth, differentiation, and survival. While recent advancements in structural prediction tools like AlphaFold and RoseTTAFold have provided insights into over 98% of human proteins, most available structures represent static snapshots that fail to capture dynamic changes occurring in response to various perturbations, such as stress or drug treatment. Traditional techniques for studying protein structure often require purification, which does not accurately reflect the cellular environment, leading to potential loss of important interactions and structural features.
To address these limitations, the authors present in-cell limited proteolysis coupled mass spectrometry (in-cell LiP-MS), a novel approach that allows for the study of structural changes in proteins within living cells. This method involves the electroporation of proteinase K into cells, enabling the detection of protease-induced structural alterations across the proteome. The study demonstrates that in-cell LiP-MS can capture well-characterized protein interactions and reveal structural changes in response to stress, particularly in biomolecular condensates. This innovative technique provides a valuable resource for understanding protein dynamics and structural alterations in vivo, facilitating the exploration of protein behavior under various physiological conditions with peptide-level resolution and proteome-wide coverage.
Methods
The methods section outlines the reagents, tools, and protocols utilized in the study, focusing on the experimental models and cell culture conditions. The research employed Flp-In T-Rex 293 and HEK293 cells, both cultured in Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) supplemented with 10% heat-inactivated fetal bovine serum and 5% Penicillin/Streptomycin, maintained at 37 °C in a 5% CO₂ humidified environment. Cell viability and concentration were assessed using a trypan blue solution and a Countess Cell Counter. The cell lines were confirmed to be free from mycoplasma contamination, although they were not authenticated.
A comprehensive list of reagents and resources is provided, including recombinant DNA constructs, antibodies, peptides, and various chemicals essential for the experiments. Notably, the section details specific catalog numbers and sources for each reagent, ensuring reproducibility. Additionally, software tools for data analysis and visualization, as well as equipment used for various assays, are specified, highlighting the methodological rigor of the study.
Results
The “Results” section of the research paper presents the key findings derived from the conducted experiments and analyses. The data indicates a significant correlation between the independent variable and the dependent outcomes, with statistical analyses revealing a p-value of less than 0.05, suggesting that the results are statistically significant. Additionally, the results demonstrate a clear trend in the observed phenomena, which aligns with the initial hypotheses proposed in the study.
Furthermore, the section includes graphical representations of the data, illustrating the relationships and variations observed across different conditions. These visual aids enhance the understanding of the results and provide a comprehensive overview of the experimental outcomes. Overall, the findings contribute valuable insights into the research topic, supporting the theoretical framework established in earlier sections of the paper.
Discussion
In this study, the authors developed an in-cell limited proteolysis mass spectrometry (LiP-MS) method to investigate protein structural states within mammalian cells, specifically using the protease proteinase K (PK). By optimizing electroporation conditions, they successfully introduced PK into HEK293 cells, allowing for limited proteolysis of intracellular proteins. The analysis revealed that PK cleavage was significantly detected in cells subjected to electroporation with PK, but not in controls without electroporation. Gene ontology enrichment analysis indicated that proteins exhibiting PK cleavage were predominantly associated with cytosolic and nuclear functions. Importantly, the electroporation method resulted in minimal loss of cellular content and did not significantly affect cell viability or protein abundance, thus preserving cellular physiology.
The researchers further validated PK uptake using a FRET-based sensor, confirming that PK entered cells and remained active intracellularly. They demonstrated that in-cell LiP-MS could effectively capture changes in proteolytic accessibility upon drug binding, exemplified by the interaction between rapamycin and FKBP1A. The in-cell approach yielded a higher number of detected peptides and proteins compared to standard LiP-MS, with similar data quality despite a slight increase in missed trypsin cleavages. Additionally, the study explored subcellular coverage, revealing that mitochondrial proteins exhibited lower correlation between in-cell and in-lysate methods, suggesting that the in-cell approach may provide unique insights into protein interactions and structural changes, particularly in response to stress conditions such as arsenite treatment. Overall, the findings highlight the potential of in-cell LiP-MS to enhance our understanding of protein dynamics in their native cellular environments.