DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-025-62582-4
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40753333
تاريخ النشر: 2025-08-02
المؤلف: Tianqi Wu وآخرون
الموضوع الرئيسي: هيكل البروتين والديناميات
نظرة عامة
في هذا القسم، يقدم المؤلفون نسخة معدلة من AlphaFold2، تُسمى DEERFold، والتي تدمج توزيعات المسافات التجريبية في هيكلها لتحسين توقعات بنية البروتين. باستخدام منصة OpenFold، يتم ضبط DEERFold بدقة على بروتينات متنوعة هيكليًا لنمذجة توزيعات المسافات المستمدة من مطيافية الرنين الإلكتروني المزدوج (DEER). يتم تقييم أداء DEERFold من خلال قياس قدرته على تبديل التكوينات المتوقعة للناقلات الغشائية بناءً على توزيعات المسافات التجريبية DEER. تشير النتائج إلى أن القدرات الجوهرية لـ AlphaFold2 تقلل بشكل كبير من عدد توزيعات المسافات المطلوبة وتحسن دقة عرضها، مما يسهل زيادة الإنتاجية التجريبية.
يبرز المؤلفون أنه بينما حولت AlphaFold2 توقعات بنية البروتين من خلال الاستفادة من التعلم العميق على مجموعات بيانات تسلسل وبنية البروتينات الواسعة، إلا أن لديها قيودًا جوهرية. تشمل هذه القيود اعتمادها على جودة محاذاة التسلسل المتعددة (MSA) والافتراض بأن تسلسلًا واحدًا يتوافق مع نموذج واحد، متجاهلة المناظر التكوينية المعقدة للبروتينات. تعالج DEERFold هذه القيود من خلال السماح بتمثيل قيود المسافة كتوزيعات، مما يوسع من قابليتها للتطبيق على طرق تجريبية أخرى توفر بيانات مماثلة.
مقدمة
في هذا القسم، يتم استكشاف تطبيق DEERFold على الناقل متعدد المجالات P-glycoprotein (Pgp)، بعد استخدامه الناجح على الناقلات أحادية المجال. تم التحقيق في Pgp، الذي يتميز بنطاقه الغشائي الحلزوني ونطاقين لربط النوكليوتيدات السيتوبلازمية (NBDs)، في ظروف خالية من اللجند (أبو) وفي حالة ما بعد التحلل عالية الطاقة (ADP-Vi). يركز البحث على الديناميات التكوينية لـ Pgp، كاشفًا أن حالة الأبو تثبت بشكل أساسي التكوينات المواجهة للداخل (IF)، بينما تفضل حالة ADP-Vi التكوينات المواجهة للخارج (OF).
تشير النتائج إلى أن DEERFold يتنبأ بتكوين IF ضيق لـ Pgp مع انحراف متوسط مربع الجذر (RMSD) قدره 3.41 Å مقارنة بالهيكل التجريبي (7A65). عند دمج البيانات من المرحلة الانتقالية ADP-Vi، يتحسن الانحراف المتوسط RMSD إلى الهياكل OF (7ZK4 و 6C0V) ليصبح 3.25 Å و 3.30 Å، على التوالي. بالمقابل، تظهر التنبؤات المستندة إلى مجموعة بيانات الأبو فتحة داخلية أوسع، مع زيادة قيم الانحراف المتوسط RMSD إلى 4.90 Å للهيكل IF-wide (7ZK7) و 11.01 Å للهيكل IF-narrow (7A65) في التجربة 2. تؤكد هذه النتائج فعالية DEERFold في نمذجة الحالات التكوينية لـ Pgp وتبرز التغيرات الهيكلية الكبيرة التي تسببها ظروف كيميائية حيوية مختلفة.
طرق
في هذا القسم، يصف المؤلفون المنهجيات المستخدمة لتقييم نهج DEERFold باستخدام بيانات المسافة DEER التجريبية والمحاكاة. تم اشتقاق البيانات التجريبية من دراسات سابقة على البروتينات الغشائية، وتم تحليلها من خلال طريقتين متميزتين: استخدمت التجربة 1 نهج ملاءمة متعدد غاوسي لنمذجة توزيعات المسافات مع 2-4 مكونات غاوسية، بينما استخدمت التجربة 2 تقريبًا ذو قمة واحدة، حيث تم اختيار المكون السائد من الملاءمة متعددة الغاوس لإنشاء تمثيل أكثر تحديدًا. تم تصميم توزيعات المسافات خصيصًا لحالات تكوينية مختلفة للبروتينات، مثل PfMATE و LmrP، تحت ظروف pH متغيرة.
تشير النتائج إلى أن دمج توزيعات المسافات التجريبية يعزز بشكل كبير دقة التوقعات الهيكلية. على سبيل المثال، أظهر نموذج PfMATE غير المقيد انحرافًا متوسطًا RMSD قدره 5.19 Å عن الحالة المستهدفة IF، والذي تحسن إلى 1.32 Å عند استخدام البيانات التجريبية المقربة من التجربة 2. بالمثل، بالنسبة لـ LmrP، انخفض الانحراف المتوسط RMSD عن الحالة IF من 5.56 Å إلى 1.52 Å مع تطبيق البيانات التجريبية الخام. تشير النتائج إلى أنه بينما يمكن أن تحسن محاذاة التسلسل المتعددة الأعمق (MSAs) من اتساق التوقعات، إلا أنها قد تحد أيضًا من التنوع التكويني ما لم يتم تطبيق قيود تجريبية مثالية، كما هو موضح في التجربة 2. بشكل عام، يبرز البحث فعالية DEERFold في توجيه التوقعات الهيكلية من خلال دمج البيانات التجريبية.
نتائج
في هذا القسم، يقدم المؤلفون نتائجهم حول تطوير وتقييم طريقة لتوجيه AlphaFold2 في توقع تكوينات متعددة للبروتينات باستخدام البيانات التجريبية، وبشكل خاص المسافات المستمدة من DEER. يركز البحث على ناقلين: LmrP، وهو مضاد بروتون مرتبط من عائلة المساعدين الرئيسيين، و PfMATE، وهو ناقل متعدد الأدوية من عائلة MATE. تم وصف كلا الناقلين سابقًا من حيث تكويناتهما المواجهة للداخل (IF) والمواجهة للخارج (OF)، حيث توفر بيانات DEER توزيعات المسافات الواقعية لأغراض التقييم.
تتم الدراسة على مرحلتين، تبدأ باستخدام AlphaLink، وهو متغير من AlphaFold2 يدمج قيود الربط من الأحماض الأمينية الضوئية. يوضح المؤلفون أن نمذجة قيود المسافة كتوزيعات غاوسية، بدلاً من قيم ثابتة، يمكّن AlphaLink من أخذ عينات فعالة من تكوينات متعددة. يجدون أن نطاق الانحراف المعياري من 2 إلى 3 Å يسمح بتنوع كافٍ في أخذ العينات التكوينية، بينما قد تعيق التوزيعات الأوسع عملية التنبؤ. توفر هذه الرؤى معلومات لتحسين AlphaFold2 لدمج توزيعات المسافات DEER بشكل أفضل، مما يعزز في النهاية قدراته التنبؤية لتكوينات البروتين.
نقاش
في هذا القسم، يناقش المؤلفون قيود استخدام توزيعات المسافات التجريبية للعلامات المغناطيسية كمدخلات لـ AlphaLink في توقع بنية البروتين، بشكل خاص للناقلات PfMATE و LmrP. أدت المحاولات الأولية لنمذجة هذه المسافات إلى اختلافات كبيرة بين المسافات المتوقعة والفعلية Cα-Cα، مما يشير إلى أن النهج كان غير كافٍ. ثم يقدم المؤلفون DEERFold، وهي طريقة مصقولة تدمج توزيعات المسافات DEER في إطار عمل AlphaFold2. من خلال استخدام وحدة Evoformer، يعزز DEERFold قدرة النموذج على دمج قيود المسافة، مما يؤدي إلى تحسين التوقعات حتى مع بيانات مدخلات محدودة. من الجدير بالذكر أن المحاكاة أظهرت أن أزواج العلامات المغناطيسية المحسّنة يمكن أن توجه بشكل فعال التبديل التكويني، محققة انحرافات متوسطة مربعة منخفضة (RMSD) نحو الحالات المستهدفة.
يقيم المؤلفون أيضًا أداء DEERFold عبر مجموعة متنوعة من أهداف البروتين، مشددين على قدرته على تحقيق التبديل التكويني مع قيود مسافة محدودة. يؤكدون على أهمية اختيار قيود المسافة ذات المحتوى العالي من المعلومات وضبط عمق محاذاة التسلسل المتعددة (MSA) لتحسين التوقعات. تشير النتائج إلى أن DEERFold يمكن أن يقود النماذج بنجاح نحو التكوينات المستهدفة، متفوقًا على التوقعات غير المقيدة ومظهرًا قابليته العامة للتطبيق خارج الناقلات الغشائية. تختتم المناقشة بإمكانية DEERFold لدمج أنواع بيانات تجريبية إضافية، مما يعزز دقة وموثوقية توقعات بنية البروتين.
DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-025-62582-4
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40753333
Publication Date: 2025-08-02
Author(s): Tianqi Wu et al.
Primary Topic: Protein Structure and Dynamics
Overview
In this section, the authors present a modified version of AlphaFold2, termed DEERFold, which integrates experimental distance distributions into its architecture for enhanced protein structure prediction. Utilizing the OpenFold platform, DEERFold is fine-tuned on structurally diverse proteins to explicitly model distance distributions derived from Double Electron-Electron Resonance (DEER) spectroscopy. The performance of DEERFold is benchmarked by assessing its ability to switch predicted conformations of membrane transporters based on experimental DEER distance distributions. The results indicate that the intrinsic capabilities of AlphaFold2 significantly reduce the number of required distance distributions and improve the accuracy of their widths, thereby facilitating greater experimental throughput.
The authors highlight that while AlphaFold2 has transformed protein structure prediction by leveraging deep learning on extensive protein sequence and structure datasets, it has inherent limitations. These include its dependence on the quality of multiple sequence alignments (MSA) and the assumption that a single sequence corresponds to a singular model, neglecting the complex conformational landscapes of proteins. DEERFold addresses these limitations by allowing for the representation of distance constraints as distributions, thus broadening its applicability to other experimental methods that provide similar data.
Introduction
In this section, the application of DEERFold to the multidomain ABC transporter P-glycoprotein (Pgp) is explored, following its successful use on single-domain transporters. Pgp, characterized by its helical transmembrane domain and two cytoplasmic nucleotide binding domains (NBDs), was investigated under ligand-free (apo) conditions and in a high-energy post-hydrolysis state (ADP-Vi). The study focuses on the conformational dynamics of Pgp, revealing that the apo condition stabilizes predominantly inward-facing (IF) conformations, while the ADP-Vi condition favors outward-facing (OF) conformations.
The results indicate that DEERFold predicts a narrow IF conformation of Pgp with a median root mean square deviation (RMSD) of 3.41 Å compared to the experimental structure (7A65). When incorporating data from the ADP-Vi intermediate, the median RMSD to the OF structures (7ZK4 and 6C0V) improves to 3.25 Å and 3.30 Å, respectively. In contrast, predictions based on the apo dataset show a wider intracellular opening, with median RMSD values increasing to 4.90 Å for the IF-wide structure (7ZK7) and 11.01 Å for the IF-narrow structure (7A65) in Experiment 2. These findings underscore the effectiveness of DEERFold in modeling the conformational states of Pgp and highlight the significant structural variations induced by different biochemical conditions.
Methods
In this section, the authors describe the methodologies employed to evaluate the DEERFold approach using both experimental and simulated DEER distance data. The experimental data were derived from previous studies on membrane proteins, analyzed through two distinct methods: Experiment 1 utilized a Multi-Gaussian fitting approach to model distance distributions with 2-4 Gaussian components, while Experiment 2 employed a Single-peak approximation, selecting the dominant component from the Multi-Gaussian fit to create a more defined representation. The distance distributions were specifically tailored for different conformational states of proteins, such as PfMATE and LmrP, under varying pH conditions.
The results indicate that incorporating experimental distance distributions significantly enhances the accuracy of structural predictions. For instance, the unconstrained PfMATE model showed a median RMSD of 5.19 Å to the target IF state, which improved to 1.32 Å when using approximated experimental data from Experiment 2. Similarly, for LmrP, the median RMSD to the IF state decreased from 5.56 Å to 1.52 Å with the application of raw experimental data. The findings suggest that while deeper multiple sequence alignments (MSAs) can improve prediction consistency, they may also limit conformational diversity unless idealized experimental restraints are applied, as demonstrated in Experiment 2. Overall, the study highlights the effectiveness of DEERFold in guiding structural predictions through the integration of experimental data.
Results
In this section, the authors present their findings on the development and benchmarking of a method to guide AlphaFold2 in predicting multiple conformations of proteins using experimental data, specifically DEER-derived spin label distances. The study focuses on two transporters: LmrP, a proton-coupled antiporter from the major facilitator superfamily, and PfMATE, a multidrug transporter from the MATE superfamily. Both transporters have been previously characterized in terms of their inward-facing (IF) and outward-facing (OF) conformations, with DEER data providing real-world distance distributions for benchmarking purposes.
The investigation is conducted in two phases, beginning with the use of AlphaLink, a variant of AlphaFold2 that incorporates crosslink constraints from photo amino acids. The authors demonstrate that modeling distance constraints as Gaussian distributions, rather than fixed values, enables AlphaLink to effectively sample multiple conformations. They find that a standard deviation range of 2 to 3 Å allows for sufficient variability in conformational sampling, while broader distributions may hinder the prediction process. These insights inform the refinement of AlphaFold2 to better integrate DEER distance distributions, ultimately enhancing its predictive capabilities for protein conformations.
Discussion
In this section, the authors discuss the limitations of using experimental spin label distance distributions as inputs for AlphaLink in protein structure prediction, specifically for the transporters PfMATE and LmrP. Initial attempts to model these distances resulted in significant discrepancies between predicted and actual Cα-Cα distances, indicating that the approach was inadequate. The authors then introduce DEERFold, a refined method that integrates DEER distance distributions into the AlphaFold2 framework. By utilizing the Evoformer module, DEERFold enhances the model’s ability to incorporate distance constraints, leading to improved predictions even with limited input data. Notably, simulations demonstrated that optimized spin label pairs could effectively guide conformational switching, achieving low root mean square deviations (RMSD) to target states.
The authors further evaluate DEERFold’s performance across a diverse set of protein targets, highlighting its ability to achieve conformational switching with minimal distance constraints. They emphasize the importance of selecting high-information content distance constraints and adjusting multiple sequence alignment (MSA) depth to optimize predictions. The results indicate that DEERFold can successfully drive models toward target conformations, outperforming unconstrained predictions and demonstrating its general applicability beyond membrane transporters. The discussion concludes with the potential for DEERFold to integrate additional experimental data types, thereby enhancing the accuracy and reliability of protein structure predictions.