DOI: https://doi.org/10.1038/s44318-024-00117-1
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38811853
تاريخ النشر: 2024-05-29
المؤلف: Pablo Martí‐Andrés وآخرون
الموضوع الرئيسي: السيلينيوم في الأنظمة البيولوجية
نظرة عامة
في هذه الدراسة، يحقق المؤلفون في الآلية التي تقلل بها الخلايا السيستين، وهي خطوة حاسمة لاستخدام السيستين في عمليات مثل تخليق البروتين والغلوثاثيون. يحددون بروتين الثيوريدوكسين المرتبط بوزن 14 كيلو دالتون (TRP14)، المشفر بواسطة TXNDC17، كإنزيم محدد لمعدل تقليل السيستين داخل الخلايا. يؤدي الإزالة الجينية لـ TRP14 إلى تحويل تخليق السيستين بشكل أساسي إلى مسار التحويل الكبريتي في خلايا الإنسان، ويثبت الإزالة المتزامنة لكلا المسارين أنها قاتلة في C. elegans تحت ضغط بروتوتوكسي.
بالإضافة إلى ذلك، يظهر أن TRP14 يقلل من التعديلات السيستينية على البروتينات، مما يعيد نشاطها الوظيفي، كما يتضح من عمله على البيروكسيريدكسين 2 المعدل بالسيستين. ومن المثير للاهتمام، أن الفئران التي تم حذف Txndc17 تظهر حماية في نموذج التهاب البنكرياس الحاد، والذي يتوافق مع تنشيط مسارات مضادات الأكسدة المدفوعة بـ Nrf2 وزيادة تنظيم التحويل الكبريتي. تؤكد النتائج على أن TRP14 هو إنزيم محفوظ تطوريًا ضروري لتقليل السيستين داخل الخلايا عبر الأنواع، بما في ذلك C. elegans والفئران والبشر.
مقدمة
تناقش المقدمة دور امتصاص السيستين في الخلايا، وخاصة من خلال الناقل xCT (SLC7A11)، الذي يعد حاسمًا لتوفير السيستين، خاصة في خلايا الورم وأثناء الضغط التأكسدي. بينما يعد تقليل السيستين إلى سيستين أمرًا حيويًا، تظل الآليات الداخلية المحددة غير واضحة، على الرغم من أن أنظمة الثيوريدوكسين (Trx) والغلوثاثيون (GSH) متورطة. تم تحديد بروتين الثيوريدوكسين المرتبط بوزن 14 كيلو دالتون (TRP14)، وهو بروتين فريد من نوعه على شكل Trx، كلاعب رئيسي محتمل في هذه العملية. أشارت الدراسات السابقة إلى أن TRP14 أكثر كفاءة من Trx1 في تقليل السيستين، لكن دوره الفسيولوجي في الجسم الحي لم يتم تحديده.
تكشف هذه الدراسة أن TRP14 هو المختزل المحدد لمعدل التحويل السيتوزولي للسيستين إلى سيستين ويمكنه تقليل البروتينات المعدلة بالسيستين. تسلط النتائج الضوء على أهمية TRP14 في ظل ظروف الضغط التأكسدي، كما يتضح في الكائنات النموذجية مثل C. elegans وخلايا الإنسان والفئران. من الجدير بالذكر أن حذف TRP14 في وجود الضغط التأكسدي يؤدي إلى زيادة تنشيط Nrf2 وزيادة تنظيم مسار التحويل الكبريتي، مما يشير إلى آلية وقائية ضد تلف الخلايا على الرغم من فقدان وظيفة TRP14. يبرز هذا التفاعل بين TRP14 واستقلاب السيستين حفظه التطوري وأهميته المحتملة في إشارات الأكسدة والاستجابة للضغط.
طرق
في هذا القسم، يوضح المؤلفون المنهجيات المستخدمة لاستنساخ وتعبير وتنقية البروتينات المختلفة، بما في ذلك TRP14 البشري وTrx1 وTrxR1 وPrx2، بالإضافة إلى TRXR-1 وTRP14 من C. elegans. تم التعبير عن هذه البروتينات وتنقيتها بشكل متجدد وفقًا للبروتوكولات المعتمدة المشار إليها من الدراسات السابقة (Pader et al., 2014; Dóka et al., 2016, 2020; Cheng and Arnér, 2017, 2018). تم توفير تسلسلات الأحماض الأمينية لبروتينات C. elegans في الجدول الملحق S6.
بالإضافة إلى ذلك، يصف المؤلفون ظروف زراعة خلايا HEK293، التي تم الحفاظ عليها في وسط Eagle’s الأساسي الأدنى (EMEM) معززًا بـ 10% مصل جنين البقر (FBS) والمضادات الحيوية وسيلينيد الصوديوم. كما تضمن الوسط تركيزات محددة من ثنائي هيدروكلوريد L-Cystine وL-Methionine. تم حضن الخلايا عند 37 درجة مئوية في جو رطب مع 5% CO₂ وتمت مراقبتها بانتظام للتأكد من عدم تلوثها بالمايكوبلازما لضمان سلامة الزراعة.
نتائج
يقدم قسم “النتائج” من ورقة البحث النتائج الرئيسية المستمدة من التجارب أو التحليلات التي تم إجراؤها. يوضح النتائج التي توصلت إليها الدراسة، مع تسليط الضوء على نقاط البيانات والاتجاهات المهمة التي تم ملاحظتها. من المحتمل أن تكون النتائج مدعومة بتحليلات إحصائية، والتي قد تشمل قيم p، وفترات الثقة، أو مقاييس ذات صلة أخرى للتحقق من النتائج.
بالإضافة إلى ذلك، قد يتضمن القسم تمثيلات بصرية مثل الرسوم البيانية أو الجداول لتوضيح البيانات بشكل فعال. تساعد هذه الوسائل البصرية في تعزيز فهم النتائج وتوفير مقارنة واضحة بين المتغيرات أو الظروف المختلفة التي تم اختبارها في الدراسة. بشكل عام، تسهم النتائج في الفهم الأوسع لسؤال البحث وقد تقترح تداعيات للدراسات المستقبلية أو التطبيقات العملية.
مناقشة
تسلط الدراسة الضوء على الدور الحاسم لـ TRP14 كإنزيم محدد لمعدل تقليل السيستين داخل الخلايا في خلايا HEK293 البشرية وC. elegans والفئران. يؤدي حذف TRP14 إلى إعاقة كبيرة في تقليل السيستين، على الرغم من أنه ينشط مسار التحويل الكبريتي لتعويض إمدادات السيستين. في خلايا حذف TRP14، لوحظت مستويات مرتفعة من السيستاثيون والسيستين، مما يشير إلى زيادة نشاط التحويل الكبريتي. ومن المثير للاهتمام، أن الفئران التي تم حذف TRP14 أظهرت مقاومة للضغط التأكسدي أثناء التهاب البنكرياس الحاد، مما يعزى إلى تعزيز تنشيط Nrf2 وزيادة تنظيم مسار التحويل الكبريتي، مما يشير إلى آلية وقائية ضد تلف الأنسجة.
علاوة على ذلك، أظهر TRP14 أنه يقلل مباشرة من البروتينات المعدلة بالسيستين، بما في ذلك البيروكسيريدكسين 2، مما ينظم نشاطها. وجدت الدراسة أنه بينما يكون TRP14 غير ضروري في الظروف العادية، فإن غيابه بالتزامن مع ضعف التحويل الكبريتي يؤدي إلى القتل تحت ضغط بروتوتوكسي في C. elegans. في المقابل، أدى حذف TRP14 في الفئران إلى انخفاض التهاب البنكرياس أثناء التهاب البنكرياس الحاد، مما يبرز دور الإنزيم في توازن السيستين وتوازن الأكسدة. بشكل عام، يعد TRP14 ومسار التحويل الكبريتي ضروريين للحفاظ على حالة الأكسدة الخلوية وتعديل بروتين السيستين، مع تداعيات لفهم مختلف الأمراض المرتبطة بالضغط التأكسدي.
DOI: https://doi.org/10.1038/s44318-024-00117-1
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38811853
Publication Date: 2024-05-29
Author(s): Pablo Martí‐Andrés et al.
Primary Topic: Selenium in Biological Systems
Overview
In this study, the authors investigate the mechanism by which cells reduce cystine, a crucial step for utilizing cysteine in processes such as protein and glutathione synthesis. They identify the thioredoxin-related protein of 14 kDa (TRP14), encoded by TXNDC17, as the rate-limiting enzyme for intracellular cystine reduction. Genetic knockout of TRP14 shifts cysteine synthesis predominantly to the transsulfuration pathway in human cells, and simultaneous knockout of both pathways proves lethal in C. elegans under proteotoxic stress.
Additionally, TRP14 is shown to reduce cysteinyl modifications on proteins, thereby restoring their functional activities, exemplified by its action on cysteinylated peroxiredoxin 2. Interestingly, Txndc17 knockout mice exhibit protection in an acute pancreatitis model, which correlates with the activation of Nrf2-driven antioxidant pathways and an upregulation of transsulfuration. The findings underscore TRP14 as an evolutionarily conserved enzyme essential for intracellular cystine reduction across species, including C. elegans, mice, and humans.
Introduction
The introduction discusses the role of cystine uptake in cells, particularly through the xCT transporter (SLC7A11), which is crucial for providing cysteine, especially in tumor cells and during oxidative stress. While the reduction of cystine to cysteine is vital, the specific intracellular mechanisms remain unclear, although the thioredoxin (Trx) and glutathione (GSH) systems are implicated. The thioredoxin-related protein of 14 kDa (TRP14), a unique Trx-fold protein, has been identified as a potential key player in this process. Previous studies indicated that TRP14 is more efficient than Trx1 in reducing cystine, but its physiological role in vivo had not been established.
This study reveals that TRP14 is the rate-limiting reductase for the cytosolic conversion of cystine to cysteine and can reduce cysteinylated proteins. The findings highlight the significance of TRP14 under oxidative stress conditions, as demonstrated in model organisms such as C. elegans, human cells, and mice. Notably, TRP14 knockout in the presence of oxidative stress leads to increased activation of Nrf2 and upregulation of the transsulfuration pathway, suggesting a protective mechanism against cellular damage despite the loss of TRP14 function. This interplay between TRP14 and cysteine metabolism underscores its evolutionary conservation and potential importance in redox signaling and stress responses.
Methods
In this section, the authors detail the methodologies employed for the cloning, expression, and purification of various proteins, including human TRP14, Trx1, TrxR1, and Prx2, as well as the C. elegans TRXR-1 and TRP14. These proteins were recombinantly expressed and purified following established protocols referenced from previous studies (Pader et al., 2014; Dóka et al., 2016, 2020; Cheng and Arnér, 2017, 2018). The amino acid sequences for the C. elegans proteins are provided in Appendix Table S6.
Additionally, the authors describe the culture conditions for HEK293 cells, which were maintained in Eagle’s minimum essential medium (EMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), antibiotics, and sodium selenite. The medium also included specific concentrations of L-Cystine dihydrochloride and L-Methionine. The cells were incubated at 37 °C in a humidified atmosphere with 5% CO₂ and were regularly monitored for mycoplasma contamination to ensure culture integrity.
Results
The “Results” section of the research paper presents the key findings derived from the conducted experiments or analyses. It details the outcomes of the study, highlighting significant data points and trends observed. The results are likely supported by statistical analyses, which may include p-values, confidence intervals, or other relevant metrics to validate the findings.
Additionally, the section may include visual representations such as graphs or tables to illustrate the data effectively. These visual aids serve to enhance the understanding of the results and provide a clear comparison of different variables or conditions tested in the study. Overall, the findings contribute to the broader understanding of the research question and may suggest implications for future studies or practical applications.
Discussion
The research highlights the critical role of TRP14 as the rate-limiting enzyme for intracellular cystine reduction in human HEK293 cells, C. elegans, and mice. Deletion of TRP14 significantly impairs cystine reduction, although it activates the transsulfuration pathway to compensate for cysteine supply. In TRP14 knockout cells, increased levels of cystathionine and cysteine were observed, indicating heightened transsulfuration activity. Interestingly, TRP14 knockout mice exhibited resistance to oxidative stress during acute pancreatitis, attributed to enhanced Nrf2 activation and transsulfuration pathway upregulation, suggesting a protective mechanism against tissue damage.
Furthermore, TRP14 was shown to directly reduce cysteinylated proteins, including peroxiredoxin 2, thereby regulating their activity. The study found that while TRP14 is dispensable under normal conditions, its absence in conjunction with impaired transsulfuration leads to lethality under proteotoxic stress in C. elegans. In contrast, TRP14 knockout in mice resulted in lower pancreatic inflammation during acute pancreatitis, underscoring the enzyme’s role in cysteine homeostasis and redox balance. Overall, TRP14 and the transsulfuration pathway are essential for maintaining cellular redox status and protein cysteinylation, with implications for understanding various pathologies linked to oxidative stress.