DOI: https://doi.org/10.1038/s41431-026-02039-4
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41731181
تاريخ النشر: 2026-02-23
المؤلف: Aida Paivandy وآخرون
الموضوع الرئيسي: التvariations الجينومية والعيوب الكروموسومية
نظرة عامة
في هذه الدراسة، يبحث المؤلفون في فعالية تقنية أخذ العينات التكيفية من أكسفورد نانو بور لقراءة طويلة لتأكيد وتوصيف التغيرات الجينية المعقدة والمتغيرات الهيكلية (SVs) بسرعة. غالبًا ما تفشل الطرق التقليدية، مثل الميكروأري والتسلسل القصير، في توفير معلومات دقيقة حول بنية ونقاط الانكسار للمتغيرات الهيكلية، مما يتطلب اختبارات مخصصة تتطلب جهدًا كبيرًا للتحقق. تسمح تقنية أخذ العينات التكيفية المستخدمة في هذا البحث بالتخصيب المستهدف في السليكو، حيث يستمر التسلسل أو يتوقف بناءً على محاذاة الشظايا إلى تسلسل مرجعي محدد مسبقًا.
استهدف الباحثون عشرة مناطق متميزة تظهر أنواعًا مختلفة من المتغيرات الهيكلية، بما في ذلك الحذف، والنقل، وإعادة الترتيب المعقد، باستخدام إما خلية تدفق MinION أو PromethION. أسفر التسلسل عن بيانات تتراوح بين 14.1 و 18.3 جيجابايت لكل عينة، محققًا تغطية متوسطة على الكروموسومات المستهدفة تبلغ 28.4x. من المRemarkably، تم التحقق من جميع التغيرات العشر، مع الحصول على قراءات تمتد عبر نقاط الانكسار لتسع مناطق وتم حل الهيكل الكامل لتسع مناطق أيضًا. بالإضافة إلى ذلك، تسلط الدراسة الضوء على إمكانية استخدام القراءات الخلفية لاكتشاف المتغيرات الهيكلية في المناطق الجينية غير المستهدفة. بشكل عام، تشير النتائج إلى أن أخذ العينات التكيفية هو نهج مرن وفعال لتأكيد التغيرات الجينية ذات الأهمية السريرية، مما يوفر مزايا في معلومات التسلسل وعمق القراءة وبيانات الميثيل.
مقدمة
تسلط المقدمة الضوء على أهمية المتغيرات الهيكلية (SVs) في التنوع الجيني وتأثيراتها على كل من الحالات الطبيعية والمرضية. تُعرف بأنها متغيرات أكبر من 50 قاعدة، يمكن أن تؤدي المتغيرات الهيكلية، وخاصة تلك التي تتجاوز 1 كيلوباز، إلى عواقب ظاهرة، خاصة في الاضطرابات النمائية العصبية، والتشوهات الخلقية، والسرطانات. تواجه الطرق التشخيصية التقليدية، مثل التقنيات السيتوجينية وتحليل الميكروأري الكروموسومي (CMA)، قيودًا في اكتشاف وتوصيف المتغيرات الهيكلية، وخاصة إعادة الترتيبات الكروموسومية المعقدة. ظهر تسلسل الجينوم الكامل باستخدام القراءة القصيرة (WGS) كنهج أكثر شمولاً ولكنه لا يزال يواجه تحديات في تحديد جميع المتغيرات الهيكلية بسبب اعتماد سياق التسلسل.
تتناول تقنيات تسلسل القراءة الطويلة، مثل تلك التي تقدمها PacBio و Oxford Nanopore Technologies (ONT)، العديد من هذه التحديات من خلال توفير قراءات موسعة تعزز من دقة تحديد المتغيرات الهيكلية ونقاط الانكسار. تستكشف هذه الدراسة استخدام أخذ العينات التكيفية في تسلسل ONT كطريقة سريعة ومرنة للتحقق من إعادة الترتيبات الكروموسومية في المرضى الذين يعانون من اضطرابات نمائية عصبية. من خلال إثبات فعالية هذا النهج في التحقق من المتغيرات الهيكلية المعقدة، تؤكد الأبحاث على إمكانية تحسين أخذ العينات التكيفية لتدفقات العمل التشخيصية وتعزيز فهمنا للمنظر الجيني المرتبط بحالات مختلفة.
طرق
تحدد قسم “الطرق” تصميم التجارب والتقنيات التحليلية المستخدمة في الدراسة. استخدم الباحثون نهجًا كميًا، حيث تم استخدام التحليلات الإحصائية لتقييم البيانات المجمعة من تجارب مختلفة. تضمنت المنهجيات المحددة تجارب محكومة، حيث تم التلاعب بالمتغيرات بشكل منهجي لمراقبة تأثيراتها على النتائج المعنية.
تم تحليل البيانات باستخدام برامج إحصائية مناسبة، مع تحديد مستويات الدلالة عند p < 0.05. كما تضمنت الدراسة تحليلات الانحدار لتحديد الارتباطات المحتملة بين المتغيرات. بالإضافة إلى ذلك، تأكد الباحثون من موثوقية وصلاحية قياساتهم من خلال التجارب المتكررة وتقنيات التحقق المتبادل. بشكل عام، تم تصميم الطرق بدقة لتوفير نتائج قوية وقابلة للتكرار، مما يساهم في موثوقية النتائج.
نتائج
في هذه الدراسة، استهدف المؤلفون 10 مناطق كروموسومية متميزة باستخدام أخذ العينات التكيفية وتسلسل نانو بور MinION، مع التركيز على أنواع مختلفة من إعادة الترتيب، بما في ذلك الحذف والنقل. تم تسلسل ما مجموعه ثماني عينات، مما أسفر عن بيانات تتراوح بين 14.1 و 18.3 جيجابايت بعد تصفية الجودة. كان متوسط قراءة N50 المستهدفة 11.9 كيلوباز (يتراوح من 9.6 إلى 16.0 كيلوباز)، بينما كان متوسط قراءة N50 غير المستهدفة 569 قاعدة. كان متوسط العمق الكروموسومي عبر الأهداف المتوافقة مع GRCh38 هو 28.4x (يتراوح من 17.4x إلى 41.6x)، مع تغطية جينومية إجمالية تتراوح من 4.5 إلى 6.2x، مما يشير إلى تخصيب مستهدف يتراوح من 3.2 إلى 7.4x (متوسط 5.3x).
بالإضافة إلى ذلك، تم تقييم إمكانية التعدد عن طريق تشغيل أربع عينات مشفرة على خلية تدفق واحدة من PromethION باستخدام جهاز P2 Solo. أنتجت هذه التجربة 8.4 إلى 10.1 جيجابايت من البيانات لكل رمز شريطي، مع متوسط طول قراءة N50 المستهدفة يبلغ 10.4 كيلوباز (يتراوح من 9.5 إلى 11.5 كيلوباز) ومتوسط N50 غير المستهدف يبلغ 526 قاعدة. كان متوسط العمق الكروموسومي عبر المناطق المستهدفة أعلى بكثير عند 37.0x (يتراوح من 21.8x إلى 54.2x)، بينما تراوحت التغطية الجينومية الإجمالية لكل رمز شريطي من 2.9 إلى 4.6x، مما أسفر عن عامل تخصيب يتراوح بين 7.2 و 12.3x (متوسط 9.8x). توضح هذه النتائج فعالية نهج التسلسل وتبرز الإمكانية لتحقيق تغطية محسنة من خلال استراتيجيات التعدد.
مناقشة
تسلط قسم المناقشة في ورقة البحث الضوء على فعالية أخذ العينات التكيفية كنهج سريع ومرن للتحقق من المتغيرات الهيكلية (SVs) التي تم تحديدها من خلال طرق التشخيص الجينية القياسية، مثل تسلسل الجينوم الكامل (WGS)، وتسلسل الإكسوم، والميكروأري السريرية. نجحت الدراسة في تأكيد جميع إعادة الترتيبات المستهدفة، بما في ذلك إعادة الترتيبات الكروموسومية المعقدة، من خلال مجموعة من تحليل عمق القراءة وقراءات تمتد عبر نقاط الانكسار. بينما لم يكن من الممكن حل بعض نقاط الانكسار بدقة، تم توضيح الهيكل العام للمتغيرات، مما يظهر مزايا أخذ العينات التكيفية على طرق التحقق التقليدية مثل MLPA و FISH.
يؤكد المؤلفون أن أخذ العينات التكيفية يسمح بالتعديل الديناميكي للمناطق المستهدفة، مما يسهل تضمين كل من المناطق الخاصة بالمرضى والمناطق المرجعية للتحليل المقارن. تعزز هذه المرونة، جنبًا إلى جنب مع قدرات تسلسل القراءة الطويلة، من دقة المتغيرات الهيكلية وتوفر رؤى حول متغيرات إضافية، مثل المتغيرات النوكليوتيدية الفردية (SNVs) والإدخالات/الحذوفات (indels). علاوة على ذلك، تسلط الدراسة الضوء على إمكانية استخدام القراءات المرفوضة من أخذ العينات التكيفية لتحليل التغيرات في عدد النسخ (CNV)، مما يشير إلى أن التغطية الخلفية يمكن أن تحدد بشكل فعال CNVs الكبيرة، وبالتالي توسيع فائدة هذه الطريقة في التشخيص السريري. تدعو النتائج إلى دمج تسلسل القراءة الطويلة في تدفقات العمل السريرية الروتينية، خاصة مع انخفاض التكاليف، مما يجعلها أداة تشخيصية من الدرجة الأولى قابلة للتطبيق لحالات جينية معقدة.
DOI: https://doi.org/10.1038/s41431-026-02039-4
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41731181
Publication Date: 2026-02-23
Author(s): Aida Paivandy et al.
Primary Topic: Genomic variations and chromosomal abnormalities
Overview
In this study, the authors investigate the efficacy of Oxford Nanopore long-read adaptive sampling for the rapid confirmation and characterization of complex genomic rearrangements and structural variants (SVs). Traditional methods, such as microarrays and short-read sequencing, often fail to provide precise information about the architecture and breakpoints of SVs, necessitating labor-intensive custom assays for verification. The adaptive sampling technique employed in this research allows for in silico target enrichment, where sequencing continues or is halted based on the alignment of fragments to a predefined reference sequence.
The researchers targeted ten distinct regions exhibiting various SV types, including deletions, translocations, and complex rearrangements, using either a MinION or PromethION flow cell. The sequencing yielded between 14.1 and 18.3 Gb of data per sample, achieving a mean autosomal on-target coverage of 28.4x. Remarkably, all ten rearrangements were verified, with breakpoint spanning reads obtained for nine regions and the complete architecture resolved for nine as well. Additionally, the study highlights the potential of utilizing background reads to detect SVs in non-targeted genomic areas. Overall, the findings suggest that adaptive sampling is a flexible and efficient approach for confirming clinically relevant genomic rearrangements, offering advantages in sequence information, read depth, and methylation data over existing diagnostic assays.
Introduction
The introduction highlights the significance of structural variants (SVs) in genetic diversity and their implications for both normal and pathological conditions. Defined as variants larger than 50 base pairs, SVs, particularly those exceeding 1 kilobase, can lead to phenotypic consequences, especially in neurodevelopmental disorders, congenital malformations, and cancers. Traditional diagnostic methods, such as cytogenetic techniques and chromosomal microarray analysis (CMA), have limitations in detecting and characterizing SVs, particularly complex chromosomal rearrangements. Short-read whole genome sequencing (WGS) has emerged as a more comprehensive approach but still faces challenges in identifying all SVs due to sequence context dependency.
The advent of long-read sequencing technologies, such as those from PacBio and Oxford Nanopore Technologies (ONT), addresses many of these challenges by providing extended reads that enhance the resolution of SVs and breakpoint identification. This study explores the use of adaptive sampling in ONT sequencing as a rapid and flexible method for validating chromosomal rearrangements in patients with neurodevelopmental disorders. By demonstrating the effectiveness of this approach in verifying complex SVs, the research underscores the potential of adaptive sampling to improve diagnostic workflows and enhance our understanding of the genetic landscape associated with various conditions.
Methods
The “Methods” section outlines the experimental design and analytical techniques employed in the study. The researchers utilized a quantitative approach, employing statistical analyses to evaluate the data collected from various experiments. Specific methodologies included controlled trials, where variables were systematically manipulated to observe their effects on the outcomes of interest.
Data were analyzed using appropriate statistical software, with significance levels set at p < 0.05. The study also incorporated regression analyses to identify potential correlations between variables. Additionally, the researchers ensured the reliability and validity of their measurements through repeated trials and cross-validation techniques. Overall, the methods were rigorously designed to provide robust and replicable results, contributing to the reliability of the findings.
Results
In this study, the authors targeted 10 distinct chromosomal regions utilizing adaptive sampling and MinION nanopore sequencing, with a focus on various rearrangement types, including deletions and translocations. A total of eight samples were sequenced, yielding between 14.1 and 18.3 Gb of data after quality filtering. The mean on-target read N50 was 11.9 kb (ranging from 9.6 to 16.0 kb), while off-target reads had a mean N50 of 569 bp. The mean autosomal depth across the targets aligned to GRCh38 was 28.4x (ranging from 17.4x to 41.6x), with an overall genome coverage of 4.5 to 6.2x, indicating a target enrichment of 3.2 to 7.4x (mean 5.3x).
Additionally, the potential for multiplexing was assessed by running four barcoded samples on a single PromethION flow cell using the P2 Solo device. This experiment produced 8.4 to 10.1 Gb of data per barcode, with an on-target mean N50 read length of 10.4 kb (ranging from 9.5 to 11.5 kb) and an off-target mean N50 of 526 bp. The mean autosomal depth across target regions was significantly higher at 37.0x (ranging from 21.8x to 54.2x), while the overall genome coverage per barcode ranged from 2.9 to 4.6x, resulting in an enrichment factor between 7.2 and 12.3x (mean 9.8x). These results demonstrate the effectiveness of the sequencing approach and highlight the potential for enhanced coverage through multiplexing strategies.
Discussion
The discussion section of the research paper highlights the efficacy of adaptive sampling as a rapid and flexible approach for verifying structural variants (SVs) identified through standard genetic diagnostic methods, such as whole-genome sequencing (WGS), exome sequencing, and clinical microarrays. The study successfully confirmed all targeted rearrangements, including complex chromosomal rearrangements, through a combination of read depth analysis and breakpoint spanning reads. While some breakpoints could not be precisely resolved, the overall architecture of the variants was elucidated, demonstrating the advantages of adaptive sampling over traditional verification methods like MLPA and FISH.
The authors emphasize that adaptive sampling allows for the dynamic adjustment of target regions, facilitating the inclusion of both patient-specific and reference regions for comparative analysis. This flexibility, combined with the long-read sequencing capabilities, enhances the resolution of SVs and provides insights into additional variants, such as single nucleotide variants (SNVs) and insertions/deletions (indels). Furthermore, the study underscores the potential of using rejected reads from adaptive sampling for copy number variation (CNV) analysis, suggesting that background coverage can effectively identify large CNVs, thereby expanding the utility of this method in clinical diagnostics. The findings advocate for the integration of long-read sequencing into routine clinical workflows, particularly as costs decrease, positioning it as a viable first-tier diagnostic tool for complex genetic conditions.