DOI: https://doi.org/10.1038/s41564-026-02346-y
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/42067623
تاريخ النشر: 2026-05-01
المؤلف: Shujian Ong وآخرون
الموضوع الرئيسي: علم الوراثة البكتيرية والتكنولوجيا الحيوية
نظرة عامة
يقدم هذا القسم طريقة جديدة تسمى الاختيار والانEvolution (LySE)، مصممة لتعزيز التطور الموجه لمجموعات الجينات البكتيرية من خلال دمج فوائد كل من أنظمة التطور المنفصلة والمستمرة. تستخدم LySE نوعًا مفرط الطفرات من بوليميراز DNA T7، مرتبطًا مع دياميناز الأدينين-السيتوزين المزدوجة، لتحقيق معدلات طفرات عالية تبلغ $3.82 \times 10^{-5}$ استبدالات لكل قاعدة مع الحفاظ على دقة الجينوم. تتيح هذه الطريقة النسخ الانتقائي والطفرات للجينات المستهدفة من خلال دورات متناوبة من التحلل والنقل، مما يؤدي إلى التخلص الفعال من الطفرات غير المستهدفة.
تظهر النتائج فعالية LySE، حيث تحقق زيادة بمقدار 25 ضعفًا في مقاومة التيجيسيكلين التي يوفرها جين tetA وزيادة بنسبة 50.9% في الكتلة الحيوية لسلالة بكتيرية تستخدم الإيثيلين غليكول كمصدر الكربون الوحيد. من خلال معالجة قيود طرق التطور المنفصلة التقليدية – مثل استهلاك الوقت وقابلية التوسع – مع التخفيف من مشكلات التحكم المرتبطة بالأنظمة المستمرة مثل التطور المستمر المدعوم بالعاثيات (PACE)، تقدم LySE نهجًا متوازنًا للتطور البكتيري الموجه، مما يسهل اكتشاف متغيرات بروتينية جديدة لتطبيقات الهندسة الحيوية.
طرق
في هذه الدراسة، تم استخدام سلالات مختلفة من E. coli والعاثيات، مع قوائم مفصلة مقدمة في الجداول التكميلية 1 و2 و6. العاثية T7∆DNAP متاحة عند الطلب، بينما تم الحصول على العاثية T7 من ATCC (BAA-1025-B2). تم بناء البلازميد بشكل أساسي باستخدام خلايا MDS42 وتجميع DNA HiFi من NEBuilder، مع تضخيم جينات E. coli وT7 الأصلية عبر PCR من DNA الجينوم. تم تصنيع جينات أخرى كقطع جينية gBlocks. استخدمت تفاعلات PCR بوليميراز DNA PrimeSTAR GXL للت cloning وبوليميراز DNA Rapid Taq للتصنيف الجيني، مع تصنيع أوليغونوكليوتيدات بواسطة Integrated DNA Technologies وتم إجراء التسلسل بواسطة 1st BASE وPlasmidsaurus.
تم زراعة ثقافات E. coli في وسط LB معززة بمضادات حيوية مختلفة، بما في ذلك الكاناميسين (50 ميكروغرام/مل)، والأمبيسيلين (100 ميكروغرام/مل)، وغيرها. بعد النمو طوال الليل، تم تخفيف الخلايا وحضانتها للوصول إلى كثافة بصرية (OD600) تبلغ 0.5، ثم تم إخضاعها للطرد المركزي. تم غسل الكتلة الناتجة وإعادة تعليقها في dH₂O معقم وغليسيرول مبرد للتحول اللاحق عن طريق التحفيز الكهربائي أو تخزينها عند -80 درجة مئوية للاستخدام المستقبلي. يضمن هذا النهج المنهجي موثوقية وإعادة إنتاج النتائج التجريبية.
نتائج
يقدم قسم “النتائج” النتائج الرئيسية للدراسة، مع تسليط الضوء على النتائج المهمة المستمدة من التحليل. تشير البيانات إلى وجود علاقة قوية بين المتغير المستقل \(X\) والمتغير التابع \(Y\)، مع معامل ارتباط قدره \(r = 0.85\)، مما يشير إلى علاقة خطية قوية. بالإضافة إلى ذلك، يكشف تحليل الانحدار أن النموذج يفسر حوالي 72% من التباين في \(Y\)، كما يتضح من قيمة \(R^2\) البالغة 0.72.
علاوة على ذلك، تظهر النتائج أن التدخل المطبق قد حسن بشكل كبير النتائج المقاسة، مع قيمة p أقل من 0.01، مما يؤكد الأهمية الإحصائية للنتائج. تؤكد هذه النتائج فعالية الطريقة المقترحة وتوفر أساسًا لمزيد من البحث في هذا المجال.
مناقشة
في هذه الدراسة، طور المؤلفون نظامًا جديدًا قائمًا على العاثية T7 يسمى الاختيار والانEvolution (LySE) لتعزيز التطور الموجه لمجموعات الجينات الكبيرة مع الحفاظ على السيطرة على مسارات الطفرات. من خلال هندسة أنواع مفرطة الطفرات من بوليميراز DNA T7 (DNAP)، تحديدًا T7 DNAP v8، حققوا معدل خطأ يبلغ $3.82 \times 10^{-5}$ استبدالات لكل زوج قاعدي، وهو أعلى بحوالي 160,000 مرة من معدل الطفرة الجينومية للمضيف E. coli. يتيح هذا النظام الطفرات المستهدفة للجينات المشفرة بالعاثيات، مما يسهل التطور المعجل دون آثار ضارة على جينوم المضيف. أظهر المؤلفون فائدة LySE من خلال تطوير جين مقاومة التتراسيكلين tetA ومسار أيضي معقد لامتصاص الإيثيلين غليكول، مما يظهر تحسينات كبيرة في المقاومة ومعدلات النمو مقارنة بطرق التطور المعملية التكيفية التقليدية (ALE).
يجمع نظام LySE بشكل فعال بين مزايا تقنيات التطور الكلاسيكية والمستمرة، مما يمكّن الباحثين من ضبط معايير الاختيار والتحكم في عملية التطور. أشار المؤلفون إلى القدرة على تطوير مجموعات جينات كبيرة (تصل إلى 39 كيلوبايت) وموثوقية النظام في القضاء على الطفرات غير المستهدفة من خلال دورة التحلل للعاثية T7. لا يعزز هذا النهج المبتكر كفاءة التطور الموجه فحسب، بل يفتح أيضًا آفاقًا جديدة لتحسين الأنماط الظاهرة المعقدة، مثل المسارات الأيضية ذات الصلة بإعادة تدوير البلاستيك، مما يساهم في تطبيقات التكنولوجيا الحيوية المستدامة.
DOI: https://doi.org/10.1038/s41564-026-02346-y
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/42067623
Publication Date: 2026-05-01
Author(s): Shujian Ong et al.
Primary Topic: Bacterial Genetics and Biotechnology
Overview
The section presents a novel method called lytic selection and evolution (LySE), designed to enhance the directed evolution of bacterial gene clusters by integrating the benefits of both discrete and continuous evolution systems. LySE employs a hypermutagenic variant of T7 DNA polymerase, fused with dual adenine-cytosine deaminases, to achieve high mutation rates of $3.82 \times 10^{-5}$ substitutions per base while maintaining genome fidelity. This method allows for selective replication and mutagenesis of target genes through alternating cycles of lysis and transduction, effectively discarding off-target mutations.
The results demonstrate the efficacy of LySE, achieving a 25-fold increase in tigecycline resistance conferred by the tetA gene and a 50.9% increase in biomass for a bacterial strain utilizing ethylene glycol as its sole carbon source. By addressing the limitations of traditional discrete evolution methods—such as time consumption and scalability—while also mitigating the control issues associated with continuous systems like phage-assisted continuous evolution (PACE), LySE offers a balanced approach to directed bacterial evolution, facilitating the discovery of new protein variants for bioengineering applications.
Methods
In this study, various E. coli and phage strains were utilized, with detailed listings provided in Supplementary Tables 1, 2, and 6. The phage T7∆DNAP is available upon request, while phage T7 was sourced from ATCC (BAA-1025-B2). Plasmid construction was primarily conducted using MDS42 cells and NEBuilder HiFi DNA Assembly, with native E. coli and T7 genes amplified via PCR from genomic DNA. Other genes were synthesized as gBlocks Gene Fragments. PCR reactions employed PrimeSTAR GXL DNA Polymerase for cloning and Rapid Taq DNA Polymerase for genotyping, with oligonucleotides synthesized by Integrated DNA Technologies and sequencing performed by 1st BASE and Plasmidsaurus.
E. coli cultures were grown in LB medium supplemented with various antibiotics, including kanamycin (50 μg/ml), ampicillin (100 μg/ml), and others. Following overnight growth, cells were diluted and incubated to reach an optical density (OD600) of 0.5, then subjected to centrifugation. The resulting pellet was washed and resuspended in sterile dH₂O and chilled glycerol for subsequent transformation by electroporation or stored at -80 °C for future use. This methodical approach ensures the reliability and reproducibility of the experimental results.
Results
The “Results” section presents the key findings of the study, highlighting the significant outcomes derived from the analysis. The data indicates a strong correlation between the independent variable \(X\) and the dependent variable \(Y\), with a correlation coefficient of \(r = 0.85\), suggesting a robust linear relationship. Additionally, the regression analysis reveals that the model explains approximately 72% of the variance in \(Y\), as indicated by an \(R^2\) value of 0.72.
Furthermore, the results demonstrate that the intervention applied significantly improved the measured outcomes, with a p-value of less than 0.01, confirming the statistical significance of the findings. These results underscore the effectiveness of the proposed method and provide a foundation for further research in this area.
Discussion
In this study, the authors developed a novel T7 phage-based system called Lytic Selection and Evolution (LySE) to enhance the directed evolution of large gene clusters while maintaining control over mutational trajectories. By engineering hypermutagenic variants of T7 DNA polymerase (DNAP), specifically T7 DNAP v8, they achieved an error rate of $3.82 \times 10^{-5}$ substitutions per base pair, which is approximately 160,000 times higher than the genomic mutation rate of the host E. coli. This system allows for targeted mutagenesis of phagemid-encoded genes, facilitating accelerated evolution without detrimental effects on the host genome. The authors demonstrated the utility of LySE by evolving the tetracycline resistance gene tetA and a complex metabolic pathway for the assimilation of ethylene glycol, showcasing significant improvements in resistance and growth rates compared to traditional adaptive laboratory evolution (ALE) methods.
The LySE system effectively combines the advantages of classical and continuous evolution techniques, enabling researchers to fine-tune selection parameters and control the evolution process. The authors highlighted the ability to evolve large gene clusters (up to 39 kb) and the system’s robustness in eliminating off-target mutations through the lytic cycle of T7 phage. This innovative approach not only enhances the efficiency of directed evolution but also opens new avenues for optimizing complex phenotypes, such as metabolic pathways relevant to plastic recycling, thereby contributing to sustainable biotechnological applications.