DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-024-07935-7
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39261738
تاريخ النشر: 2024-09-11
المؤلف: Keisuke Motone وآخرون
الموضوع الرئيسي: دراسات نقل المسام النانوية والقنوات النانوية
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة طريقة جديدة لتسلسل جزيئات البروتين الفردية في شكلها الأصلي الكامل باستخدام مجموعة حساسات نانوية تجارية. تعتمد الطريقة على ClpX unfoldase لنقل البروتينات عبر مسام CsgG، مما يكشف أن ClpX ينقل الركائز بخطوات من اثنين من الأحماض الأمينية. يسمح هذا الآلية بالكشف عن أحماض أمينية فردية في خيوط بروتين اصطناعية يمكن أن تكون مئات الأحماض الأمينية طويلة، مما يسهل تسلسل استبدالات الأحماض الأمينية الفردية ورسم خرائط التعديلات بعد الترجمة، مثل الفسفرة.
لتحسين دقة التصنيف، يظهر المؤلفون القدرة على إعادة قراءة جزيئات البروتين الفردية عدة مرات واستكشاف الإمكانية لتسلسل باركود البروتين بدقة. بالإضافة إلى ذلك، يطورون نموذجًا حيويًا يحاكي إشارات المسام النانوية الخام بناءً على حجم الشق والشحنة، مما يساعد في تفسير البيانات. تُطبق الطرق لتحليل مجالات البروتين المطوية كاملة الطول، مما يوفر إثباتًا للمفهوم لمنصة قادرة على تحديد وتوصيف أشكال البروتين كاملة الطول بدقة جزيئية فردية.
مقدمة
في هذا القسم، يستكشف المؤلفون فعالية طريقتهم المعتمدة على unfoldase القائمة على cis على البروتينات ذات المجالات المطوية، مع تحليل بروتين PASTOR الذي يحتوي على مجال titin I27 V15P. يلاحظون أن آثار المسام النانوية لبروتين PASTOR-titin تكشف عن حالة التقاط كهربائية ثنائية الخطوات، مما يشير إلى الالتقاط الأولي لمجال titin المطوي يليه تفكيكه. يؤدي إضافة ClpX إلى إشارات النقل المرتبطة بمناطق البروتين VR وYY، مع حالات حجب مميزة تشير إلى محاولات ClpX لتفكيك مجال titin. من الجدير بالذكر أن الدراسة تسلط الضوء على الاختلافات في سلوك التفكيك بين PASTOR-titin ونموذج غير المستقر، PASTOR-D-titin، الذي أظهر محاولات تفكيك أقل نجاحًا وميزات إشارة مميزة، مما يبرز تأثير الهيكل الثلاثي على ديناميات التفكيك.
يكشف التحليل الإضافي مع بروتينات الأميلويد-β (PASTOR-Aβ42 وPASTOR-Aβ15) أن هذه البروتينات، على الرغم من تسلسلاتها وأطوالها المميزة، تولد إشارات تفكيك مشابهة ولكن فريدة، مما يعزز الفكرة بأن تسلسل الأحماض الأمينية الأولية يؤثر بشكل كبير على إشارات النقل عبر المسام النانوية. يبلغ معدل النقل المبلغ عنه حوالي 63 حمضًا أمينيًا في الثانية، وهو متسق مع النتائج السابقة حول سرعة نقل ClpX. أخيرًا، يظهر النموذج التنبؤي الذي طوره المؤلفون دقة عالية في محاكاة آثار التيار للبروتينات ذات المجالات المطوية، حيث يحتل مرتبة في أعلى 0.04% من أفضل المطابقات، مما يثبت فعالية النموذج في هذا السياق.
طرق
في قسم الطرق، يشير المؤلفون إلى أن بلازميدات التعبير البروتيني المستخدمة في دراستهم يمكن الوصول إليها من خلال Addgene، وهو مستودع معروف للبلازميدات. تسهل هذه التوفر إمكانية إعادة الإنتاج وتسمح للباحثين الآخرين باستخدام نفس المواد لمزيد من التحقيق أو التحقق من النتائج المقدمة في الورقة. تؤكد توفير هذه الموارد التزام المؤلفين بالشفافية والتعاون داخل المجتمع العلمي.
مناقشة
في هذه الدراسة، نقدم نهجًا جديدًا لتسلسل البروتينات على مستوى الجزيء الفردي باستخدام ClpX كنوع من البروتين المحرك بالتزامن مع تقنية المسام النانوية. تعالج طريقتنا القيود السابقة من خلال استخدام عملية مبسطة من خطوتين: أولاً، إدخال ركيزة البروتين في المسام النانوية عبر القوة الكهربائية، يليها إضافة ClpX لاستخراج البروتين مرة أخرى. قمنا بتخليق سلسلة من البروتينات مع طفرات محددة لتقييم حساسية طريقتنا تجاه الأحماض الأمينية الفردية، مما يكشف عن توقيعات تيار أيوني مميزة تتوافق مع هذه الطفرات. من الجدير بالذكر أننا أثبتنا أن ClpX ينقل حوالي 1.96 من الشقوق في كل خطوة، مع زمن إقامة قدره 28.6 مللي ثانية، مما يتماشى مع الدراسات الهيكلية التي تقترح سلوك خطوات من حمضين أمينيين.
علاوة على ذلك، طورنا نموذج تصنيف قائم على التعلم الآلي لتحديد طفرات الأحماض الأمينية داخل إشارات المسام النانوية، محققين معدلات دقة عالية في التمييز بين الأحماض الأمينية المختلفة. تشير نتائجنا إلى أن الطريقة قادرة على توليد مكتبات واسعة من تسلسلات الببتيد الاصطناعية، مع توقعات بأكثر من مليار باركود فريد. بالإضافة إلى ذلك، أظهرنا القدرة على الكشف ورسم خرائط التعديلات الإنزيمية بعد الترجمة (PTMs) من خلال تحليل أحداث الفسفرة في تسلسلات بروتينية محددة، مما يبرز إمكانيات هذه التقنية في تعزيز ترميز البروتينات والبروتيوميات. بشكل عام، يمثل هذا العمل تقدمًا كبيرًا في مجال تسلسل البروتينات، حيث يقدم طريقة حساسة وفعالة لتحليل الهياكل والتعديلات البروتينية المعقدة.
DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-024-07935-7
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39261738
Publication Date: 2024-09-11
Author(s): Keisuke Motone et al.
Primary Topic: Nanopore and Nanochannel Transport Studies
Overview
This research presents a novel method for sequencing single protein molecules in their native, full-length form using a commercial nanopore sensor array. The approach leverages the ClpX unfoldase to translocate proteins through a CsgG nanopore, revealing that ClpX moves substrates in two-residue steps. This mechanism allows for the detection of single amino acids in synthetic protein strands that can be hundreds of amino acids long, facilitating the sequencing of single-amino-acid substitutions and the mapping of post-translational modifications, such as phosphorylation.
To improve classification accuracy, the authors demonstrate the capability to reread individual protein molecules multiple times and explore the potential for precise protein barcode sequencing. Additionally, they develop a biophysical model that simulates raw nanopore signals based on residue volume and charge, aiding in the interpretation of the data. The methods are applied to analyze full-length, folded protein domains, providing a proof of concept for a platform capable of identifying and characterizing full-length proteoforms at single-molecule resolution.
Introduction
In this section, the authors investigate the effectiveness of their cis-based unfoldase method on proteins with folded domains, specifically analyzing the PASTOR protein containing the titin I27 V15P domain. They observe that the nanopore traces of PASTOR-titin reveal a two-step electrophoretic capture state, indicating the initial capture of the folded titin domain followed by its unfolding. The addition of ClpX leads to translocation signals associated with the protein’s VR and YY regions, with distinct blockade states suggesting ClpX’s attempts to unfold the titin domain. Notably, the study highlights differences in unfolding behavior between PASTOR-titin and a destabilized variant, PASTOR-D-titin, which exhibited fewer successful unfolding attempts and distinct signal features, underscoring the influence of tertiary structure on unfolding dynamics.
Further analysis with amyloid-β proteins (PASTOR-Aβ42 and PASTOR-Aβ15) reveals that these proteins, despite their distinct sequences and lengths, generate similar but unique unfolding signals, reinforcing the idea that primary amino acid sequence significantly impacts translocation signals through the nanopore. The authors report a translocation rate of approximately 63 amino acids per second, consistent with previous findings on ClpX translocation speed. Finally, the predictive model developed by the authors demonstrates high accuracy in simulating current traces for proteins with folded domains, ranking in the top 0.04% of best matches, thus validating the model’s effectiveness in this context.
Methods
In the Methods section, the authors indicate that the protein expression plasmids utilized in their study can be accessed through Addgene, a well-known repository for plasmids. This availability facilitates reproducibility and allows other researchers to utilize the same materials for further investigation or validation of the findings presented in the paper. The provision of these resources underscores the authors’ commitment to transparency and collaboration within the scientific community.
Discussion
In this study, we present a novel approach for single-molecule protein sequencing utilizing ClpX as a motor protein in conjunction with nanopore technology. Our method addresses previous limitations by employing a streamlined two-step process: first, threading the protein substrate into the nanopore via electrophoretic force, followed by the addition of ClpX to extract the protein back out. We synthesized a series of proteins with specific mutations to evaluate the sensitivity of our method to single amino acids, revealing distinct ionic current signatures corresponding to these mutations. Notably, we established that ClpX translocates approximately 1.96 residues per step, with a dwell time of 28.6 ms, aligning with structural studies suggesting a two-amino-acid stepping behavior.
Furthermore, we developed a machine learning-based classification model to identify amino acid mutations within the nanopore signals, achieving high accuracy rates in distinguishing between various amino acids. Our findings indicate that the method is capable of generating extensive libraries of synthetic peptide sequences, with projections of over 1 billion unique barcodes. Additionally, we demonstrated the ability to detect and map enzymatic post-translational modifications (PTMs) by analyzing phosphorylation events in specific protein sequences, showcasing the potential of this technology for advancing protein barcoding and proteomics. Overall, this work represents a significant advancement in the field of protein sequencing, offering a sensitive and efficient method for analyzing complex protein structures and modifications.