DOI: https://doi.org/10.1038/s41420-025-02295-1
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39828750
تاريخ النشر: 2025-01-19
المؤلف: Martin Škandík وآخرون
الموضوع الرئيسي: آليات الالتهاب العصبي والتنكس العصبي
نظرة عامة
ترتبط عملية الشيخوخة بانخفاض في وظائف الخلايا، مما يؤثر بشكل خاص على الجهازين المناعي والعصبي. تركز هذه الدراسة على التغيرات الظاهرية في الخلايا الدبقية الصغيرة، وهي خلايا المناعة في الدماغ، خلال الشيخوخة، والتي لا تزال مثيرة للجدل وتعتمد على النماذج التجريبية. باستخدام خلايا الدبقية الصغيرة BV-2 المزروعة على المدى الطويل والتي تفتقر إلى المحفزات الخارجية، تكشف الأبحاث أن الخلايا الدبقية الصغيرة المسنّة تظهر ملف تعبير جيني مميز، يتميز بشكل أساسي بالتغيرات في استجابتها المناعية. بينما أثارت المحفزات المؤيدة للالتهابات استجابات ترنسكريبتومية مماثلة في كل من الخلايا الدبقية الصغيرة المسنّة والشابة، كانت شدة الاستجابة منخفضة بشكل ملحوظ في الخلايا المسنّة. أظهرت الاختبارات الوظيفية أن زراعة الخلايا مع الخلايا الدبقية الصغيرة المسنّة النشطة أدت إلى موت عصبي أقل، مما يبرز استجابة مناعية ضعيفة.
كما حددت الدراسة 13 جينًا متداخلًا بين خلايا الدبقية الصغيرة BV-2 المسنّة ومجموعات البيانات الترنسكريبتومية المعتمدة من الفئران والإنسان المسنّين، مما يثبت وجود توقيع محتمل لشيخوخة الدبقية الصغيرة. ومن الجدير بالذكر أن الجينات SLC16A3 و P2RY13 أظهرت زيادة مستمرة في التعبير وانخفاضًا على التوالي. كشفت التحقيقات في SLC16A3، التي تشفر الناقل اللاكتاتي MCT4، عن اضطرابات مرتبطة بالعمر في ديناميات اللاكتات، بينما كانت التغيرات في استشعار البيورين والحركة مرتبطة بـ P2RY12/P2RY13. أكدت التحقق في أنسجة الدماغ البشرية زيادة التعبير عن MCT4 وانخفاض التعبير عن P2RY12 في الخلايا الدبقية الصغيرة المسنّة. بشكل عام، توضح هذه الدراسة ظاهرة فريدة من نوعها للخلايا الدبقية الصغيرة المسنّة تتميز بانخفاض الاستجابة المناعية وتحدد العوامل الجزيئية الرئيسية التي قد تُعلم استراتيجيات معالجة الاضطرابات العصبية المرتبطة بالعمر.
مقدمة
تسلط مقدمة هذه الورقة البحثية الضوء على تأثير الشيخوخة على الجهاز العصبي، مع التركيز بشكل خاص على عدم تنظيم الخلايا الدبقية الصغيرة، وهي خلايا المناعة المقيمة في الجهاز العصبي المركزي. مع تقدم الأفراد في العمر، تساهم زيادة الإجهاد التأكسدي والالتهابات في زيادة خطر الإصابة بمختلف الاضطرابات العصبية، بما في ذلك الأمراض التنكسية العصبية والحالات الوعائية الدماغية. تمر الخلايا الدبقية الصغيرة بتغيرات ترنسكريبتومية وشكلية كبيرة، حيث تنتقل إلى حالة أقل تشعبًا وأكثر تفاعلية، مما يضعف قدرتها على الحفاظ على توازن الدماغ ويزيد من القابلية للإصابة بالأمراض المرتبطة بالعمر.
تناقش الورقة أيضًا تعقيدات دراسة شيخوخة الخلايا الدبقية الصغيرة، مشيرة إلى أنه بينما تعيش الخلايا الدبقية الصغيرة لفترة طويلة وتظهر قدرات تجديد ذاتي قوية، توجد أدلة متضاربة بشأن علامات الشيخوخة في نماذج الخلايا الدبقية الصغيرة. يشير المؤلفون إلى أن العديد من الدراسات تستخدم ثدييات مسنّة تعرضت لتحديات بيئية إضافية، مما يعقد تفسير شيخوخة الخلايا الدبقية الصغيرة بشكل مستقل عن هذه العوامل. لمعالجة هذه التحديات، تقدم الدراسة نموذجًا جديدًا في المختبر باستخدام خلايا الدبقية الصغيرة BV-2، مما يسمح بالتحقيق في عمليات الشيخوخة دون تنشيط خارجي. يهدف هذا النموذج إلى توضيح المحركات الترنسكريبتومية لشيخوخة الخلايا الدبقية الصغيرة وآثارها البيولوجية، مما يساهم في فهم أفضل لدور الخلايا الدبقية الصغيرة في الاضطرابات العصبية المرتبطة بالعمر.
طرق البحث
في هذه الدراسة، تم زراعة خلايا الدبقية الصغيرة BV-2 من ثقافات دماغية مختلطة من فئران C57BL/6 في وسط Eagle المعدل من دولبيكو (DMEM) مع إضافة البنسلين-ستربتوميسين و مصل جنين العجل عند 37 درجة مئوية في جو رطب مع 5% CO₂. تم زراعة خلايا MN9D العصبية تحت نفس الظروف. تم إجراء اختبارات دورية للكشف عن الميكوبلازما باستخدام مجموعة كشف الميكوبلازما LookOut PCR. لأغراض تجريبية، تم معالجة خلايا الدبقية الصغيرة BV-2 بـ 100 نانوغرام/مل من الليببوليسكاريد (LPS) من الإشريكية القولونية لفترات محددة.
لإنشاء نموذج خلايا دبقية صغيرة مسنّة في المختبر، تم زراعة خلايا BV-2 من المرور P15 لأكثر من 100 يوم، مع حدوث زراعة فرعية عند حوالي 90% من التلاصق. تم تجميد هذه الخلايا الدبقية الصغيرة المسنّة لاحقًا لإجراء تجارب مستقبلية، بينما تم الحصول على خلايا التحكم من مرور أقل (P5). تم إذابة كل من عينات خلايا الدبقية الصغيرة المسنّة والتحكم في نفس الوقت وتم الحفاظ عليها في الثقافة لمدة أقصاها 20 يومًا متتاليًا لمزيد من التحليل.
النتائج
في هذه الدراسة، حقق المؤلفون في التغيرات الترنسكريبتومية في خلايا الدبقية الصغيرة BV-2 المعرضة للشيخوخة الطويلة الأمد في المختبر، كاشفين عن ملف تعبير جيني مميز مرتبط بزيادة القدرة على الترجمة ولكن مع استجابات مناعية معطلة. حددت تسلسلات RNA عالية الإنتاجية 1,681 جينًا معبرًا عنه بشكل مختلف (DEGs) بين خلايا الدبقية الصغيرة المسنّة والتحكم، مع زيادة ملحوظة في التعبير عن الجينات المرتبطة بمعالجة RNA وبدء الترجمة، بينما كانت الجينات المرتبطة بالاستجابات المناعية، مثل إنتاج السيتوكينات والبلعمة، منخفضة التعبير. دعمت تحليل مسار KEGG هذه النتائج، مشيرة إلى تحول نحو تعزيز مسارات تخليق البروتين وانخفاض في المسارات المرتبطة بالمناعة، مما يشير إلى ظاهرة مناعية ضعيفة مرتبطة بالعمر في الخلايا الدبقية الصغيرة.
بالإضافة إلى ذلك، أظهرت الدراسة أن خلايا الدبقية الصغيرة المسنّة أظهرت ردود فعل أقل على المحفزات المؤيدة للالتهابات، مثل الليببوليسكاريد (LPS)، مع تحديد عدد أقل من DEGs استجابةً لعلاج LPS مقارنةً بنظرائها الأصغر سنًا. كانت هذه الاستجابة المناعية المنخفضة تتميز بتغيرات في تعبير السيتوكينات، بما في ذلك انخفاض إنتاج IL-6 وزيادة إنتاج IL-10، مما أدى إلى تقليل السمية العصبية في تجارب الزراعة المشتركة مع الخلايا العصبية الدوبامينية. تسلط النتائج الضوء على الاضطرابات الترنسكريبتومية في الاستجابات المناعية للخلايا الدبقية الصغيرة بسبب الشيخوخة وتقترح أن الخلايا الدبقية الصغيرة المسنّة قد تشترك في توقيعات ترنسكريبتومية مع الخلايا الدبقية الأولية من أدمغة الفئران والإنسان المسنّين، مما يشير إلى نموذج محتمل لدراسة شيخوخة الخلايا الدبقية الصغيرة وآثارها في الأمراض التنكسية العصبية.
المناقشة
تسلط المناقشة الضوء على التغيرات الكبيرة المرتبطة بالعمر في وظيفة الخلايا الدبقية الصغيرة، مع التركيز بشكل خاص على انخفاض التعبير عن مستقبلات البيورين P2RY12 و P2RY13 في خلايا الدبقية الصغيرة BV-2. هذه المستقبلات ضرورية لاستشعار النوكليوتيدات خارج الخلوية مثل ADP و ATP، والتي تؤثر على قدرات هجرة الخلايا الدبقية الصغيرة. استخدمت الدراسة RT-qPCR وقياس التدفق لتأكيد انخفاض مستويات mRNA والبروتين لهذه المستقبلات في الخلايا الدبقية الصغيرة المسنّة، مما يتوافق مع ضعف الهجرة كما تم توضيحه من خلال اختبارات الانتقال والجرح. تشير النتائج إلى أن الشيخوخة تغير استشعار الخلايا الدبقية الصغيرة للنوكليوتيدات وحركتها، مما يساهم في ظاهرة مناعية ضعيفة تتميز بانخفاض الاستجابة للمحفزات البيئية.
بالإضافة إلى ذلك، تؤكد الأبحاث على زيادة التعبير عن MCT4، وهو ناقل اللاكتات، في الخلايا الدبقية الصغيرة المسنّة، مما قد يلعب دورًا في التحولات الأيضية والاستجابات الالتهابية. كشفت التحليلات الترنسكريبتومية المقارنة أن خلايا الدبقية الصغيرة المسنّة BV-2 تظهر ملف تعبير جيني مشابه للخلايا الدبقية الأولية من أدمغة البشر والفئران المسنّين، مما يعزز فكرة حالة المناعة المتقدمة. تؤكد الدراسة على تعقيد شيخوخة الخلايا الدبقية الصغيرة، مشيرة إلى أن التغيرات الترنسكريبتومية الملحوظة قد تنشأ من مزيج من عمليات الشيخوخة الداخلية والعوامل الخارجية التي تم مواجهتها على مدار الحياة. بشكل عام، توفر هذه الأبحاث رؤى قيمة حول الآليات الجزيئية الكامنة وراء شيخوخة الخلايا الدبقية الصغيرة وآثارها على الأمراض التنكسية العصبية.
DOI: https://doi.org/10.1038/s41420-025-02295-1
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39828750
Publication Date: 2025-01-19
Author(s): Martin Škandík et al.
Primary Topic: Neuroinflammation and Neurodegeneration Mechanisms
Overview
The aging process is associated with a decline in cellular functions, particularly affecting the immune and neural systems. This study focuses on the phenotype changes in microglia, the brain’s immune cells, during aging, which remains contentious and dependent on experimental models. Utilizing long-term cultivated BV-2 microglia devoid of external stimuli, the research reveals that aged microglia exhibit a distinct gene expression profile, primarily marked by changes in their immune response. While pro-inflammatory stimuli elicited similar transcriptomic responses in both aged and young microglia, the intensity of the response was significantly reduced in the aged cells. Functional assays indicated that coculturing with aged activated microglia resulted in less neuronal death, highlighting a weakened immune response.
The study further identified 13 overlapping genes between aged BV-2 microglia and established transcriptomic datasets from aged mice and humans, establishing a potential microglial aging signature. Notably, genes SLC16A3 and P2RY13 showed consistent upregulation and downregulation, respectively. Investigations into SLC16A3, which encodes the lactate transporter MCT4, revealed age-related disruptions in lactate dynamics, while alterations in purine sensing and motility were linked to P2RY12/P2RY13. Validation in human brain tissue confirmed the upregulation of MCT4 and downregulation of P2RY12 in aged microglia. Overall, this study elucidates a unique phenotype of aged microglia characterized by diminished immune responsiveness and identifies key molecular factors that may inform strategies for addressing age-related neurological disorders.
Introduction
The introduction of this research paper highlights the impact of aging on the nervous system, particularly emphasizing the dysregulation of microglia, the resident immune cells of the central nervous system. As individuals age, increased oxidative stress and inflammation contribute to a heightened risk of various neurological disorders, including neurodegenerative diseases and cerebrovascular conditions. Microglia undergo significant transcriptomic and morphological changes, transitioning to a less ramified and more reactive state, which compromises their ability to maintain brain homeostasis and increases susceptibility to age-related pathologies.
The paper also discusses the complexities of studying microglial aging, noting that while microglia are long-lived and exhibit robust self-renewal capabilities, conflicting evidence exists regarding senescence markers in microglial models. The authors point out that many studies utilize aged mammals exposed to additional environmental challenges, complicating the interpretation of microglial aging independent of these factors. To address these challenges, the study introduces a novel in vitro model using BV-2 microglial cells, allowing for the investigation of aging processes without extrinsic activation. This model aims to elucidate the transcriptomic drivers of microglial aging and their biological implications, ultimately contributing to a better understanding of microglial roles in age-related neurological disorders.
Methods
In this study, mouse microglial BV-2 cells, derived from mixed brain cultures of C57BL/6 mice, were cultured in Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) supplemented with penicillin-streptomycin and fetal bovine serum at 37 °C in a humidified atmosphere with 5% CO₂. Neuronal MN9D cells were cultured under identical conditions. Regular Mycoplasma testing was conducted using the LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit. For experimental purposes, BV-2 microglia were treated with 100 ng/ml lipopolysaccharide (LPS) from Escherichia coli for specified durations.
To create an in vitro aged microglial model, BV-2 cells from passage P15 were cultivated for over 100 days, with sub-cultivation occurring at approximately 90% confluency. These aged microglia were subsequently frozen for future experiments, while control cells were derived from lower passage (P5). Both aged and control BV-2 microglial aliquots were thawed simultaneously and maintained in culture for a maximum of 20 consecutive days for further analysis.
Results
In this study, the authors investigated the transcriptomic changes in BV-2 microglia subjected to long-term in vitro aging, revealing a distinct gene expression profile associated with increased translation capacity but impaired immune responses. High-throughput RNA sequencing identified 1,681 differentially expressed genes (DEGs) between aged and control BV-2 microglia, with notable upregulation of genes linked to RNA processing and translation initiation, while genes associated with immune responses, such as cytokine production and phagocytosis, were downregulated. KEGG pathway analysis further supported these findings, indicating a shift towards enhanced protein synthesis pathways and a decline in immune-related pathways, suggesting an age-related immunocompromised phenotype in microglia.
Additionally, the study demonstrated that aged BV-2 microglia exhibited reduced reactivity to pro-inflammatory stimuli, such as lipopolysaccharide (LPS), with fewer DEGs identified in response to LPS treatment compared to younger counterparts. This diminished immune response was characterized by altered cytokine expression, including decreased IL-6 and increased IL-10 production, leading to reduced neurotoxicity in co-culture experiments with dopaminergic neurons. The findings highlight the transcriptional disruptions in microglial immune responses due to aging and suggest that aged microglia may share transcriptomic signatures with primary microglia from aged mouse and human brains, indicating a potential model for studying microglial aging and its implications in neurodegenerative diseases.
Discussion
The discussion highlights significant age-related changes in microglial function, particularly focusing on the downregulation of purinergic receptors P2RY12 and P2RY13 in BV-2 microglia. These receptors are crucial for sensing extracellular nucleotides like ADP and ATP, which influence microglial migration capabilities. The study utilized RT-qPCR and flow cytometry to confirm decreased mRNA and protein levels of these receptors in aged microglia, correlating with impaired migration as demonstrated through transwell and scratch wound assays. The findings suggest that aging alters microglial nucleotide sensing and motility, contributing to an immune-deficient phenotype characterized by diminished responsiveness to environmental stimuli.
Additionally, the research underscores the upregulation of MCT4, a lactate transporter, in aged microglia, which may play a role in metabolic shifts and inflammatory responses. Comparative transcriptomic analyses revealed that aged BV-2 microglia exhibit a gene expression profile similar to primary microglia from aged human and mouse brains, reinforcing the notion of an immunosenescent state. The study emphasizes the complexity of microglial aging, noting that the observed transcriptomic changes may arise from a combination of intrinsic aging processes and extrinsic factors encountered throughout life. Overall, this research provides valuable insights into the molecular mechanisms underlying microglial aging and their implications for neurodegenerative diseases.