DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-025-58521-y
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40188191
تاريخ النشر: 2025-04-06
المؤلف: Zhenyun Du وآخرون
الموضوع الرئيسي: تحلل الأصباغ بواسطة الإنزيمات
طرق
في هذه الدراسة، كانت جميع المواد الكيميائية المستخدمة من الدرجة التحليلية أو أعلى، مما يضمن موثوقية النتائج التجريبية. تم تصنيع البلازميدات للتعبير عن مختلف الأكسيدات متعددة النحاس (MCOs) بواسطة SynbioB في تيانجين، الصين. تضمنت المواد الكيميائية الرئيسية مسحوق مرق LB، إيزوبروبيل β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)، وكاناميسين، المأخوذة من Sangon Biotech في شنغهاي. بالإضافة إلى ذلك، تم الحصول على ملح diammonium 2,2′-Azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) و Remazol brilliant blue R (RBBR) من Aladdin Biotech، بينما تم الحصول على الكلورامفينيكول وأفلاتوكسين B1 من الدرجة HPLC من Solarbio و Innochem، على التوالي. تم الحصول على وسط Eagle المعدل من دولبيكو (DMEM)، مصل جنين العجل (FBS)، والبنسلين-ستربتوميسين من Thermo Fisher في الولايات المتحدة الأمريكية، مما يوفر مكونات أساسية لزراعة الخلايا والتجارب.
نتائج
يقدم قسم “النتائج” في ورقة البحث النتائج الرئيسية المستمدة من التجارب أو التحليلات التي أجريت. يوضح النتائج الناتجة عن اختبارات مختلفة، مع تسليط الضوء على الاتجاهات والأنماط المهمة التي لوحظت في البيانات. غالبًا ما تكون النتائج مصحوبة بتحليلات إحصائية ذات صلة، والتي قد تشمل قيم p، فترات الثقة، أو أحجام التأثير، لدعم صحة النتائج.
بالإضافة إلى ذلك، قد يتضمن القسم تمثيلات بصرية مثل الرسوم البيانية أو الجداول التي توضح العلاقات بين المتغيرات أو تأثير التدخلات. تعزز هذه المساعدات البصرية وضوح النتائج وتسمح بتفسير أسهل للبيانات المعقدة. بشكل عام، تساهم النتائج في الفهم الأوسع لسؤال البحث وقد تقترح تداعيات للدراسات المستقبلية أو التطبيقات العملية في هذا المجال.
مناقشة
في هذه الدراسة، تم تطوير إطار عمل جديد للتعلم العميق، ESM-Ezy، لتحديد الأكسيدات متعددة النحاس (MCOs) ذات التشابهات التسلسلية المنخفضة من قاعدة بيانات تسلسلية كبيرة. تتكون الطريقة من استراتيجية من مرحلتين: ضبط نموذج مدرب مسبقًا (ESM-1b) لتصنيف MCOs ومرحلة بحث لاحقة لتحديد مرشحين جدد بخصائص تحفيزية محسنة. استخدم الضبط مجموعة بيانات تتكون من 147 MCOs موصوفة ومجموعة بيانات سلبية كبيرة من 550,000 تسلسل غير MCO، محققًا دقة عالية وموثوقية كما تم تأكيده من خلال التحقق المتقاطع بخمس مرات. أظهرت تقنيات تقليل الأبعاد، مثل UMAP، تجمعات متميزة لـ MCOs، مما يثبت فعالية النموذج. تضمنت مرحلة البحث حساب المسافات الإقليدية بين إنزيمات الاستعلام المختارة (QEs) والتسلسلات من UniRef50، مما أدى إلى تحديد 18 تسلسلًا مجاورًا لمزيد من التحليل. من الجدير بالذكر أن MCOs المختارة أظهرت تشابهات تسلسلية منخفضة (25-35%) لكنها حافظت على الحفاظ الهيكلي العالي، مما يشير إلى التجديد التطوري.
أظهرت MCOs المختارة خصائص تحفيزية متفوقة مقارنةً بـ QEs الخاصة بها، حيث أظهر حوالي 40% كفاءة محسنة أو استقرار حراري في اختبارات أكسدة ABTS. من بين هذه، كان إنزيم الكبريت ملحوظًا بشكل خاص، حيث أظهر عمر نصف أطول بمقدار 3.0 مرات عند درجات حرارة مرتفعة وكفاءة تحفيزية أعلى بكثير من QEs المقابلة له. كما سلطت الدراسة الضوء على إمكانيات هذه الإنزيمات للتطبيقات الصناعية، حيث حافظت على النشاط عبر نطاق أوسع من درجات الحرارة ومستويات pH، وأظهرت مقاومة ملحوظة للمذيبات العضوية. كشفت التحليلات الهيكلية عن ميزات فريدة في MCOs ذات الأداء العالي، مثل تكوين مركز نشط متميز في Bfre، والذي شمل أيونات النحاس والمنغنيز، وهي سمة لم يتم توثيقها سابقًا في MCOs. بشكل عام، لم يسهل إطار ESM-Ezy اكتشاف MCOs عالية الأداء فحسب، بل أكد أيضًا على أهمية استكشاف مناطق التشابه التسلسلي المنخفض لتحديد الإنزيمات ذات الخصائص التحفيزية الجديدة.
DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-025-58521-y
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40188191
Publication Date: 2025-04-06
Author(s): Zhenyun Du et al.
Primary Topic: Enzyme-mediated dye degradation
Methods
In this study, all chemicals utilized were of analytical grade or higher, ensuring the reliability of experimental results. The plasmids for expressing various multicopper oxidases (MCOs) were synthesized by SynbioB in Tianjin, China. Key reagents included LB broth powder, Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG), and kanamycin, sourced from Sangon Biotech in Shanghai. Additionally, 2,2′-Azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS) and Remazol brilliant blue R (RBBR) were procured from Aladdin Biotech, while chloramphenicol and Aflatoxin B1 were obtained in HPLC grade from Solarbio and Innochem, respectively. Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), and Penicillin-Streptomycin were acquired from Thermo Fisher in the USA, providing essential components for cell culture and experimentation.
Results
The “Results” section of the research paper presents key findings derived from the conducted experiments or analyses. It details the outcomes of various tests, highlighting significant trends and patterns observed in the data. The results are often accompanied by relevant statistical analyses, which may include p-values, confidence intervals, or effect sizes, to support the validity of the findings.
Additionally, the section may include visual representations such as graphs or tables that illustrate the relationships between variables or the impact of interventions. These visual aids enhance the clarity of the results and allow for easier interpretation of complex data. Overall, the findings contribute to the broader understanding of the research question and may suggest implications for future studies or practical applications in the field.
Discussion
In this study, a novel deep learning framework, ESM-Ezy, was developed to identify multi-copper oxidases (MCOs) with low sequence similarities from a large sequence database. The approach consists of a two-stage strategy: fine-tuning a pre-trained model (ESM-1b) to classify MCOs and a subsequent searching phase to identify novel candidates with enhanced catalytic properties. The fine-tuning utilized a dataset of 147 characterized MCOs and a large negative dataset of 550,000 non-MCO sequences, achieving high accuracy and robustness as confirmed by five-fold cross-validation. Dimensionality reduction techniques, such as UMAP, illustrated distinct clustering of MCOs, validating the model’s effectiveness. The searching phase involved calculating Euclidean distances between selected query enzymes (QEs) and sequences from UniRef50, leading to the identification of 18 neighboring sequences for further analysis. Notably, the selected MCOs exhibited low sequence similarities (25-35%) but maintained high structural conservation, suggesting evolutionary novelty.
The selected MCOs demonstrated superior catalytic properties compared to their QEs, with approximately 40% showing enhanced efficiency or thermal stability in ABTS oxidation assays. Among these, the enzyme Sulfur was particularly noteworthy, exhibiting a 3.0-fold longer half-life at elevated temperatures and significantly higher catalytic efficiency than its corresponding QEs. The study also highlighted the potential of these enzymes for industrial applications, as they maintained activity across a broader range of temperatures and pH levels, and displayed remarkable resistance to organic solvents. Structural analyses revealed unique features in the top-performing MCOs, such as a distinct active center configuration in Bfre, which included both copper and manganese ions, a characteristic not previously documented in MCOs. Overall, the ESM-Ezy framework not only facilitated the discovery of high-performing MCOs but also underscored the importance of exploring low sequence similarity regions for identifying enzymes with novel catalytic properties.