DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-024-07183-9
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38480885
تاريخ النشر: 2024-03-13
المؤلف: Wen Song وآخرون
الموضوع الرئيسي: تفاعلات النباتات والميكروبات والمناعة
نظرة عامة
في هذه الدراسة، استخدم الباحثون نوع Arabidopsis thaliana الوصول Col-0 و Nicotiana benthamiana كمواد نباتية. تم وصف الطفرة الرباعية لـ N. benthamiana، المشار إليها باسم epss (eds1 pad4 sag101a sag101b)، سابقًا في الأدبيات. بالإضافة إلى ذلك، تم تطوير خط ترانسجيني من Arabidopsis يعبر عن RBA1 خصيصًا لهذا البحث.
تم التحكم بعناية في ظروف نمو النباتات؛ حيث تم زراعة نباتات Arabidopsis في حاضنة تحت دورة ضوء مدتها 10 ساعات وظلام مدته 14 ساعة عند درجة حرارة 22 درجة مئوية ورطوبة 70% لمدة تتراوح بين 4 إلى 5 أسابيع. بالمقابل، تم زراعة نباتات N. benthamiana في دفيئة تحت ظروف النهار الطويل لنفس الفترة. كانت هذه البيئات المتحكم بها ضرورية لضمان نمو وتطور متسق لمواد النباتات المستخدمة في التجارب.
مقدمة
تستعرض المقدمة دور NAD\(^+\) و ATP في فصل الطور لبروتينات مجال TIR، خاصة في سياق مسارات إشارات المناعة النباتية. تصف كيف تنشط المؤثرات الممرضة NLRs النباتية، مما يؤدي إلى تشكيل مجمعات أوليغومرية تعرف باسم مقاومات. على وجه التحديد، يؤدي تنشيط بروتينات CNL و TNL إلى تشكيل مقاومات خماسية و رباعية، على التوالي، والتي تعمل كقنوات Ca\(^{2+}\) لتسهيل الاستجابات المناعية وموت الخلايا. تعمل مقاومة TNL كإنزيم NADase هولوإنزيم، مما ينتج جزيئات مناعية صغيرة تنشط EDS1 و نظائرها، مما يسهل التجميع الإضافي لمقاومات المساعدة.
تظهر النتائج التجريبية أن بروتين RPP1-TIR يظهر نشاط NADase ويخضع لفصل الطور في وجود NAD\(^+\) و ATP، مع ملاحظة العكارة خلال ثوانٍ. بالمقابل، لا يظهر RPP1-TIR فصل الطور تحت ظروف الملح المنخفض أو في غياب هذه النيوكليوتيدات. تشير نتائج إضافية إلى أن بروتينات مجال TIR الأخرى، مثل RBA1 و TX14، تشكل أيضًا تجميعات عالية الترتيب في وجود NAD\(^+\). تستخدم الدراسة تقنيات متنوعة، بما في ذلك اختبارات ترشيح الهلام وتحليل ديناميات FRAP، لوصف هذه التفاعلات وآثارها على الاستجابات المناعية للنبات، مع نتائج متسقة عبر تكرارات تجريبية متعددة.
مناقشة
في هذه الدراسة، يستكشف المؤلفون فصل الطور والنشاط الإنزيمي لبروتينات مجال TIR (مستقبل Toll/interleukin-1) النباتية، مع التركيز بشكل خاص على RPP1-TIR و RBA1 و TX14. يظهرون أن نشاط NADase لـ RPP1-TIR يتعزز بشكل كبير عند تركيزات تزيد عن 10 ميكرومتر، مع ملاحظة زيادات إضافية عند إضافة الركائز NAD⁺ و ATP، التي تحفز فصل الطور في المختبر. بينما يشكل RPP1-TIR قطرات تشبه السائل في وجود هذه الركائز، فإن RBA1 و TX14 تولد هياكل أكبر تشبه التجمعات، مما يشير إلى اختلافات في قدراتها على التفاعل الذاتي. تحدد الدراسة منطقة BB-loop لهذه البروتينات كحرجة لفصل الطور، حيث تقلل الطفرات في هذه المنطقة من كل من فصل الطور ونشاط NADase.
علاوة على ذلك، يستكشف المؤلفون الأهمية الفسيولوجية لمكثفات TIR في الكائنات الحية، كاشفين أن تعبير RPP1-TIR و RBA1 و TX14 في Nicotiana benthamiana يؤدي إلى موت الخلايا، مع تشكيل RPP1-TIR لنقاط نووية ودون نووية ديناميكية تشير إلى فصل الطور السائل-السائل. تؤدي الطفرات في منطقة BB-loop في هذه البروتينات إلى تعطيل تشكيل المكثفات وإلغاء نشاط موت الخلايا، مما يبرز أهمية فصل الطور في الاستجابات المناعية التي تتوسطها TIR. تشير النتائج إلى أن فصل الطور المحفز بالركيزة هو آلية محفوظة تعزز النشاط الإنزيمي لـ TIR وتسهّل إشارات المناعة في النباتات، مما يربط بروتينات TIR بمسارات استجابة مناعية أوسع.
DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-024-07183-9
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38480885
Publication Date: 2024-03-13
Author(s): Wen Song et al.
Primary Topic: Plant-Microbe Interactions and Immunity
Overview
In this study, the researchers utilized Arabidopsis thaliana accession Col-0 and Nicotiana benthamiana as plant materials. The N. benthamiana quadruple mutant, referred to as epss (eds1 pad4 sag101a sag101b), was previously characterized in the literature. Additionally, a transgenic line of Arabidopsis expressing RBA1 was developed specifically for this research.
The growth conditions for the plants were carefully controlled; Arabidopsis plants were cultivated in an incubator under a 10-hour light and 14-hour dark cycle at a temperature of 22 °C and 70% humidity for a duration of 4 to 5 weeks. In contrast, N. benthamiana plants were grown in a greenhouse under long-day conditions for the same period. These controlled environments were essential for ensuring consistent growth and development of the plant materials used in the experiments.
Introduction
The introduction outlines the role of NAD\(^+\) and ATP in the phase separation of TIR domain proteins, particularly within the context of plant immunity signaling pathways. It describes how pathogen effectors activate plant NLRs, leading to the formation of oligomeric complexes known as resistosomes. Specifically, the activation of CNL and TNL proteins results in the formation of pentameric and tetrameric resistosomes, respectively, which function as Ca\(^{2+}\) channels to mediate immune responses and cell death. The TNL resistosome acts as a NADase holoenzyme, producing small immune molecules that activate EDS1 and its paralogs, facilitating further assembly of helper resistosomes.
Experimental findings demonstrate that RPP1-TIR protein exhibits NADase activity and undergoes phase separation in the presence of NAD\(^+\) and ATP, with turbidity observed within seconds. In contrast, RPP1-TIR does not exhibit phase separation under low-salt conditions or in the absence of these nucleotides. Additional results indicate that other TIR domain proteins, such as RBA1 and TX14, also form high-order assemblies in the presence of NAD\(^+\). The study employs various techniques, including gel-filtration assays and FRAP dynamics analysis, to characterize these interactions and their implications for plant immune responses, with consistent results across multiple experimental repetitions.
Discussion
In this study, the authors investigate the phase separation and enzymatic activity of plant TIR (Toll/interleukin-1 receptor) domain proteins, particularly focusing on RPP1-TIR, RBA1, and TX14. They demonstrate that the NADase activity of RPP1-TIR is significantly enhanced at concentrations above 10 μM, with further increases observed upon the addition of substrates NAD⁺ and ATP, which induce phase separation in vitro. While RPP1-TIR forms liquid-like droplets in the presence of these substrates, RBA1 and TX14 generate larger aggregate-like structures, suggesting differences in their self-association capabilities. The study identifies the BB-loop region of these proteins as critical for phase separation, as mutations in this region reduce both phase separation and NADase activity.
Furthermore, the authors explore the physiological relevance of TIR condensates in vivo, revealing that expression of RPP1-TIR, RBA1, and TX14 in Nicotiana benthamiana leads to cell death, with RPP1-TIR forming dynamic nuclear and perinuclear puncta indicative of liquid-liquid phase separation. The BB-loop mutations in these proteins disrupt condensate formation and abolish their cell death activity, underscoring the importance of phase separation in TIR-mediated immune responses. The findings suggest that substrate-induced phase separation is a conserved mechanism that enhances TIR enzymatic activity and facilitates immune signaling in plants, potentially linking TIR proteins to broader immune response pathways.