DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-024-49596-0
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38906887
تاريخ النشر: 2024-06-21
المؤلف: Alicia Bedolla وآخرون
الموضوع الرئيسي: آليات الالتهاب العصبي والتنكس العصبي
نظرة عامة
تبحث هذه القسم من ورقة البحث في دور إشارات TGF-β1 في وظيفة الخلايا الدبقية الصغيرة داخل الجهاز العصبي المركزي (CNS) للبالغين. تشير النتائج إلى أن الخلايا الدبقية الصغيرة هي المصدر الرئيسي لليغاندات TGF-β1 اللازمة للحفاظ على توازن الخلايا الدبقية الصغيرة، على عكس الخلايا النجمية أو الخلايا العصبية. تؤدي إزالة TGF-β1 في الخلايا الدبقية الصغيرة (إزالة جين Tgfb1 من الخلايا الدبقية الصغيرة، أو KO) إلى حالة نشطة تتميز بنمط نسخي مشابه لذلك الذي لوحظ في الخلايا الدبقية الصغيرة المرتبطة بالأمراض، أو المرتبطة بالإصابات، أو المتقدمة في العمر. وهذا يشير إلى أن TGF-β1 المنتج ذاتيًا ضروري لصحة الخلايا الدبقية الصغيرة ووظيفتها.
علاوة على ذلك، تسلط الدراسة الضوء على أن الخلايا النجمية في الفئران التي تم حذف TGF-β1 منها بشكل قابل للتحفيز (iKO) تظهر نمطًا نسخيًا مشابهًا للخلايا النجمية المرتبطة بـ LPS، مما يشير إلى تحول في حالتها الوظيفية. يحدد المؤلفون آلية إشارات ذاتية لـ TGF-β1 في الخلايا الدبقية الصغيرة باستخدام تقنيات KO أحادية الخلية. من المهم أن تبرز العجز المعرفي الذي لوحظ في الفئران MG-Tgfb1 iKO ضرورة تنظيم TGF-β1 من الخلايا الدبقية الصغيرة مكانيًا للحفاظ على توازن الدماغ والوظائف المعرفية الطبيعية. بشكل عام، تؤكد هذه الأبحاث على الأدوار المتعددة للخلايا الدبقية الصغيرة بخلاف المناعة الفطرية، بما في ذلك وظائفها التنظيمية في صحة الدماغ والاستجابة للإصابة أو الالتهاب.
مقدمة
تبحث الأبحاث في دور TGF-β1 المشتق من الخلايا الدبقية الصغيرة في الحفاظ على توازن الخلايا الدبقية في الفئران البالغة. تكشف الدراسة أن إزالة TGF-β1 المشتق من الخلايا الدبقية الصغيرة تؤدي إلى تغييرات شكلية كبيرة في الخلايا الدبقية الصغيرة، تتميز بتقليل التفرع والنشاط، كما يتضح من انخفاض أعداد نهايات العمليات وطول الفروع الكلي. بالإضافة إلى ذلك، هناك انخفاض ملحوظ في التعبير عن جينات التوقيع الخاصة بالخلايا الدبقية الصغيرة، مثل $P2ry12$ و $Tmem119$. تشير هذه النتائج إلى أن إشارات TGF-β1 من الخلايا الدبقية الصغيرة ضرورية لوظيفتها التوازنية، وأن غيابها لا يمكن تعويضه بـ TGF-β1 من أنواع خلايا أخرى في الجهاز العصبي المركزي (CNS).
على النقيض، تفحص الدراسة أيضًا آثار إزالة TGF-β1 المحددة للخلايا النجمية، والتي لا تؤدي إلى أي تغييرات كبيرة في شكل الخلايا الدبقية الصغيرة أو التعبير الجيني. وهذا يشير إلى أن TGF-β1 النجمية ليس ضروريًا للحفاظ على توازن الخلايا الدبقية الصغيرة. تستكشف الأبحاث أيضًا التفاعلات بين الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا النجمية، كاشفة أن فقدان إشارات TGF-β في الخلايا الدبقية الصغيرة ينشط كلا النوعين من الخلايا، بينما لا يؤدي حذف مستقبلات TGF-β في الخلايا النجمية إلى تغييرات مماثلة في الخلايا الدبقية الصغيرة. بشكل عام، تؤكد هذه النتائج على الدور المحدد والحاسم لـ TGF-β1 المشتق من الخلايا الدبقية الصغيرة في توازن الخلايا الدبقية، بينما تشير إلى أن TGF-β1 النجمية لا تلعب دورًا كبيرًا في الظروف الفسيولوجية الطبيعية.
الطرق
في هذه الدراسة، استخدم المؤلفون مجموعة متنوعة من خطوط الفئران المعدلة وراثيًا للتحقيق في دور جيني Tgfb1 و Alk5 في أنواع خلايا محددة. تم إبقاء الفئران تحت ظروف مسيطر عليها في جامعة سينسيناتي، مع الموافقة على جميع بروتوكولات الحيوانات من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية (IACUC). تم استخدام نظام إعادة التركيب Cre-loxP لتحقيق إما حذف جيني ثابت أو قابل للتحفيز، باستخدام خطوط قيادة Cre المختلفة التي تستهدف الخلايا المكونة للدم، والخلايا الدبقية الصغيرة، والخلايا النجمية، والخلايا العصبية المثيرة في الدماغ الأمامي. من الجدير بالذكر أن خط Cre Mgfap غير قابل للتحفيز ويستهدف بشكل فعال نسبة عالية من الخلايا النجمية خلال مراحل ما حول الولادة.
لإدارة التاموكسيفين (TAM)، اتبع المؤلفون نظام جرعات محدد بناءً على وزن جسم الفأر، حيث حصلت الفئران البالغة الشابة على جرعة كاملة قدرها 180 ملغ/كغ لمدة خمسة أيام متتالية. تم تحقيق إعادة التركيب النادرة باستخدام جرعة أقل (تخفيف 1:7 إلى 1:10)، وتم علاج الفئران حديثة الولادة بحقن يومية من TAM من الأيام 3 إلى 5 بعد الولادة. تضمنت عملية القتل الرحيم استخدام الأفيرتين تليها عملية ضخ عبر القلب، مما يضمن جمع الأعضاء الأساسية للتحليلات اللاحقة، بما في ذلك الكيمياء المناعية وقياس التدفق الخلوي. تم التأكيد على التعامل الدقيق مع جرعات TAM وبروتوكولات العلاج لمنع التلوث المتبادل بين المجموعات التجريبية.
النتائج
تظهر نتائج هذه الدراسة أن الحذف الموزائي لـ TGF-β1 في الخلايا الدبقية الصغيرة، الذي تم تحقيقه من خلال استخدام خطوط الفئران Tmem119 CreER و P2ry12 CreER، يؤدي إلى تنشيط متقطع للخلايا الدبقية. تظهر خطوط Tmem119 و P2ry12 CreER إعادة تركيب “متسربة” أقل مقارنة بخط Cx3cr1 CreER، مما يؤدي إلى نمط موزائي من حذف TGF-β1 وتنشيط لاحق للخلايا الدبقية الصغيرة. على وجه التحديد، بعد خمسة أسابيع من إدارة التاموكسيفين، لوحظت بقع متميزة من الخلايا الدبقية الصغيرة النشطة، مع درجات متفاوتة من النشاط تتوافق مع كفاءة حذف جين Tgfb1. من الجدير بالذكر أن الفئران P2ry12 CreER(mut/mut) Tgfb1 fl/fl أظهرت نمطًا ظاهريًا أكثر حدة، حيث فقد أكثر من 50% من الخلايا الدبقية الصغيرة تعبير TMEM119 وتغيرات شكلية كبيرة.
بالإضافة إلى ذلك، وجدت الدراسة أن تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة كان مرتبطًا بزيادة تنشيط الخلايا النجمية، كما يتضح من تفاعل GFAP المناعي. لوحظت علاقة متوسطة بين درجة تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة وتنشيط الخلايا النجمية، مما يدعم الفرضية القائلة بأن فقدان TGF-β1 من الخلايا الدبقية الصغيرة يعطل توازنها، مما يؤدي إلى تنشيط الخلايا النجمية. كشفت تحليل بقع الخلايا الدبقية الصغيرة الفردية عن علاقة إيجابية بين الخلايا الدبقية الصغيرة غير المتوازنة وتنشيط الخلايا النجمية المحلية، مما يشير إلى علاقة مكانية وثيقة بين هذين النوعين من الخلايا في سياق حذف TGF-β1. بشكل عام، تسلط هذه النتائج الضوء على التفاعل المعقد بين توازن الخلايا الدبقية الصغيرة وتنشيط الخلايا النجمية استجابةً لاضطراب إشارات TGF-β1.
المناقشة
في هذا القسم، يستكشف المؤلفون دور TGF-β1 الذي تنتجه الخلايا الدبقية الصغيرة في الجهاز العصبي المركزي (CNS) وآثاره على توازن الخلايا الدبقية الصغيرة. باستخدام بيانات تسلسل RNA أحادي الخلية (scRNAseq)، يثبتون أن الخلايا الدبقية الصغيرة هي المصدر الرئيسي لـ TGF-β1 في CNS، مع وجود تعبير ضئيل في أنواع خلايا أخرى مثل الخلايا النجمية والخلايا العصبية. يؤكد المؤلفون هذه النتيجة من خلال RNAscope والكيمياء المناعية، مما يظهر أن mRNA لـ TGF-β1 يتواجد بكثرة في الخلايا الدبقية الصغيرة الإيجابية لـ IBA1. كما يؤكدون الأهمية الوظيفية لـ TGF-β1 المشتق من الخلايا الدبقية الصغيرة من خلال استخدام نموذج حذف خاص بالخلايا الدبقية الصغيرة (MG-Tgfb1 iKO)، والذي يظهر انخفاضًا كبيرًا (70%) في مستويات mRNA لـ TGF-β1 عند استنفاد الخلايا الدبقية الصغيرة، مما يشير إلى أن الخلايا الدبقية الصغيرة ضرورية لإنتاج TGF-β1 في الدماغ.
تبحث الدراسة أيضًا في عواقب فقدان TGF-β1 على النسخ الجيني للخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا النجمية. بعد حذف TGF-β1 في الخلايا الدبقية الصغيرة، يحدث اضطراب ملحوظ في التعبير الجيني التوازني، مع انخفاض في جينات التوقيع الخاصة بالخلايا الدبقية الصغيرة وزيادة في جينات الالتهاب. يلاحظ المؤلفون أن الخلايا الدبقية الصغيرة تظهر خصائص مرتبطة بالشيخوخة والإصابة، مما يشير إلى انتقال إلى حالة غير متوازنة. بالإضافة إلى ذلك، يجدون أن الخلايا النجمية تستجيب أيضًا لفقدان TGF-β1 من الخلايا الدبقية الصغيرة، منتقلة إلى حالة التهابية. يستنتج المؤلفون أن إشارات TGF-β1 من الخلايا الدبقية الصغيرة ضرورية للحفاظ على التوازن في كل من الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا النجمية، وأن اضطرابها يؤدي إلى تغييرات نسخية كبيرة قد تسهم في العجز المعرفي الذي لوحظ في نموذجهم المحذوف.
DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-024-49596-0
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38906887
Publication Date: 2024-06-21
Author(s): Alicia Bedolla et al.
Primary Topic: Neuroinflammation and Neurodegeneration Mechanisms
Overview
This section of the research paper investigates the role of TGF-β1 signaling in microglial function within the adult central nervous system (CNS). The findings indicate that microglia are the primary source of TGF-β1 ligands necessary for maintaining microglial homeostasis, as opposed to astrocytes or neurons. The deletion of TGF-β1 in microglia (microglia-Tgfb1 knockout, or KO) results in an activated state characterized by a transcriptome similar to that observed in disease-associated, injury-associated, and aged microglia. This suggests that self-produced TGF-β1 is crucial for microglial health and function.
Furthermore, the study highlights that astrocytes in microglia-Tgfb1 inducible knockout (iKO) mice exhibit a transcriptomic profile akin to LPS-associated astrocytes, indicating a shift in their functional state. The authors establish an autocrine signaling mechanism for TGF-β1 in microglia using sparse mosaic single-cell KO techniques. Importantly, cognitive deficits observed in MG-Tgfb1 iKO mice underscore the necessity of spatially regulated TGF-β1 from microglia for maintaining brain homeostasis and normal cognitive functions. Overall, this research emphasizes the multifaceted roles of microglia beyond innate immunity, including their regulatory functions in brain health and response to injury or inflammation.
Introduction
The research investigates the role of microglial-derived TGF-β1 in maintaining glial homeostasis in adult mice. The study reveals that the deletion of microglia-derived TGF-β1 leads to significant morphological changes in microglia, characterized by reduced ramification and activation, as evidenced by decreased process terminal end numbers and total branch lengths. Additionally, there is a marked reduction in the expression of homeostatic microglial signature genes, such as $P2ry12$ and $Tmem119$. These findings suggest that TGF-β1 signaling from microglia is crucial for their homeostatic function, and its absence cannot be compensated by TGF-β1 from other cell types in the central nervous system (CNS).
In contrast, the study also examines the effects of astrocyte-specific deletion of TGF-β1, which does not result in any significant changes in microglial morphology or gene expression. This indicates that astrocytic TGF-β1 is not essential for maintaining microglial homeostasis. The research further explores the interactions between microglia and astrocytes, revealing that loss of TGF-β signaling in microglia activates both cell types, while deletion of TGF-β receptors in astrocytes does not induce similar changes in microglia. Overall, these findings underscore the specific and critical role of microglial TGF-β1 in glial homeostasis, while suggesting that astrocytic TGF-β1 does not play a significant role under normal physiological conditions.
Methods
In this study, the authors utilized a variety of transgenic mouse lines to investigate the role of the Tgfb1 and Alk5 genes in specific cell types. The mice were housed under controlled conditions at the University of Cincinnati, with all animal protocols approved by the Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). The Cre-loxP recombination system was employed to achieve either constitutive or inducible knockout of the target genes, using various Cre driver lines that target myeloid cells, microglia, astrocytes, and forebrain excitatory neurons. Notably, the Mgfap Cre line is non-inducible and effectively targets a high percentage of astrocytes during perinatal stages.
For the administration of tamoxifen (TAM), the authors followed a specific dosing regimen based on mouse body weight, with young adult mice receiving a full dose of 180 mg/kg for five consecutive days. Sparse recombination was achieved using a lower dosage (1:7 to 1:10 dilution), and neonatal mice were treated with daily TAM injections from postnatal days 3 to 5. The euthanasia process involved the use of avertin followed by transcardial perfusion, ensuring the collection of essential organs for subsequent analyses, including immunohistochemistry and flow cytometry. The careful handling of TAM dosing and treatment protocols was emphasized to prevent cross-contamination among experimental groups.
Results
The results of this study demonstrate that the mosaic deletion of TGF-β1 in microglia, achieved through the use of Tmem119 CreER and P2ry12 CreER mouse lines, leads to patchy activation of glial cells. The Tmem119 and P2ry12 CreER lines exhibit reduced “leaky” recombination compared to the Cx3cr1 CreER line, resulting in a mosaic pattern of TGF-β1 deletion and subsequent microglial activation. Specifically, five weeks post-tamoxifen administration, distinct patches of activated microglia were observed, with varying degrees of activation correlating with the efficiency of Tgfb1 gene deletion. Notably, the P2ry12 CreER(mut/mut) Tgfb1 fl/fl mice displayed a more severe phenotype, with over 50% of microglia losing TMEM119 expression and significant morphological changes.
Additionally, the study found that the activation of microglia was associated with increased astrocyte activation, as indicated by GFAP immunoreactivity. A moderate correlation was observed between the degree of microglial activation and astrocytic activation, supporting the hypothesis that the loss of TGF-β1 from microglia disrupts their homeostasis, leading to astrocyte activation. The analysis of individual microglial patches revealed a positive correlation between dyshomeostatic microglia and local astrocyte activation, suggesting a close spatial relationship between these two cell types in the context of TGF-β1 deletion. Overall, these findings highlight the complex interplay between microglial homeostasis and astrocyte activation in response to TGF-β1 signaling disruption.
Discussion
In this section, the authors explore the role of TGF-β1 produced by microglia in the central nervous system (CNS) and its implications for microglial homeostasis. Using single-cell RNA sequencing (scRNAseq) data, they establish that microglia are the primary source of TGF-β1 in the CNS, with minimal expression found in other cell types such as astrocytes and neurons. The authors validate this finding through RNAscope and immunohistochemistry, demonstrating that TGF-β1 mRNA is enriched in IBA1-positive microglia. They further confirm the functional significance of microglial TGF-β1 by employing a microglia-specific knockout model (MG-Tgfb1 iKO), which shows a substantial decrease (70%) in TGF-β1 mRNA levels upon microglial depletion, indicating that microglia are crucial for TGF-β1 production in the brain.
The study also investigates the consequences of TGF-β1 loss on microglial and astrocytic transcriptomics. Following the deletion of TGF-β1 in microglia, there is a marked dysregulation of homeostatic gene expression, with downregulation of microglial signature genes and upregulation of pro-inflammatory genes. The authors observe that microglia exhibit characteristics associated with aging and injury, suggesting a transition to a non-homeostatic state. Additionally, they find that astrocytes also respond to the loss of microglial TGF-β1, transitioning to a pro-inflammatory state. The authors conclude that microglial TGF-β1 signaling is essential for maintaining homeostasis in both microglia and astrocytes, and its disruption leads to significant transcriptional changes that may contribute to cognitive deficits observed in their knockout model.