DOI: https://doi.org/10.1186/s12934-024-02312-5
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38303005
تاريخ النشر: 2024-02-01
المؤلف: Ran You وآخرون
الموضوع الرئيسي: تغذية وصحة الرضع
نظرة عامة
تركز البحث على التخليق الحيوي لـ 2′-فوكوسيللاكتوز (2′-FL)، وهو أوليغوسكاريد مهم في حليب الأم، باستخدام سلالات *E. coli* المهندسة. تعتبر طرق التخليق الكيميائي التقليدية لـ 2′-FL معقدة وسامة، مما يدفع لاستكشاف الأنظمة الميكروبية. يقدم الدراسة مسار تخليق حيوي جديد يستخدم الفركتوز، محققة عائد نظري ستويكيومتري قدره 0.5 مول 2′-FL لكل مول من الفركتوز. تشمل الإنزيمات الرئيسية المشاركة في هذا المسار الفوسفو مانوميوتاز (ManB)، مانوز-1-فوسفات غوانيليترانسفيراز (ManC)، GDP-d-mannose 4,6-dehydratase (Gmd)، GDP-l-fucose synthase (WcaG)، و α-1,2-fucosyltransferase (FucT).
من خلال الهندسة الأيضية، قام الباحثون ببناء عدة سلالات *E. coli* recombinante عن طريق حذف جينات جليكوليتية محددة (pfkA، pfkB، pgi) وتحسين أنظمة التعبير المشترك للإنزيمات. كان أعلى عائد تم تحقيقه هو 0.498 مول 2′-FL لكل مول فركتوز مع السلالة RFL38، التي أنتجت أيضًا 41.6 غرام/لتر من 2′-FL في تحويل حيوي مغذي. تمثل هذه الدراسة تقدمًا كبيرًا في الإنتاج البيولوجي لـ 2′-FL من الفركتوز وتوفر رؤى حول تحسين تدفق الكربون لزيادة العوائد، والتي يمكن أن تكون قابلة للتطبيق في الإنتاج الصناعي لمركبات أخرى مشتقة من سلف جليكوليتي.
مقدمة
تسلط مقدمة ورقة البحث الضوء على أهمية أوليغوسكاريدات حليب الأم (HMOs)، وخاصة 2′-فوكوسيللاكتوز (2′-FL)، في تطوير وصحة الرضع. تعتبر HMOs ضرورية لتنظيم الفلورا المعوية، وتعديل الجهاز المناعي، ودعم تطوير الجهاز العصبي. لقد اعترفت إدارة الغذاء والدواء الأمريكية (FDA) بـ 2′-FL كمنتج آمن بشكل عام (GRAS)، وقد تم تضمينه في تركيبات الرضع لتعزيز الميكروبات المعوية المفيدة. كما أشارت الدراسات الحديثة إلى إمكاناته في الحماية العصبية وصحة خلايا الأمعاء. نظرًا لهذه الفوائد، فإن التخليق الميكروبي لـ 2′-FL يظهر كبديل قابل للتطبيق لطرق الاستخراج التقليدية والتخليق الكيميائي.
يتضمن مسار التخليق الحيوي لـ 2′-FL تحويل الفركتوز-6-فوسفات (F-6-P) إلى GDP-l-fucose، والذي يستخدم بعد ذلك لتخليق 2′-FL من اللاكتوز. يركز البحث على تحسين المسارات الأيضية في *Escherichia coli* recombinante لزيادة عائد 2′-FL. يصف المؤلفون تطوير سلالة معدلة من E. coli (SG104) التي تحسن تدفق الكربون نحو F-6-P وتزيد بعد ذلك من العائد الستويكيومتري لـ 2′-FL. من خلال سلسلة من استراتيجيات الهندسة الأيضية، بما في ذلك التعبير المفرط عن الإنزيمات الرئيسية وحذف المسارات المتنافسة، حققت الدراسة عائدًا عاليًا قدره 0.498 مول 2′-FL لكل مول من الفركتوز، مع تركيز نهائي للإنتاج قدره 41.6 غرام/لتر. يمثل هذا العمل تقدمًا كبيرًا في الإنتاج البيولوجي لـ 2′-FL، مما يضع طريقة جديدة لتخليقه من الفركتوز في *E. coli* recombinante.
طرق
في هذه الدراسة، تم قياس كثافة الخلايا عن طريق قياس الكثافة الضوئية عند 600 نانومتر باستخدام مطياف ضوئي. تم تقييم تعبير الإنزيمات الموصوفة من خلال تحليل SDS-PAGE. لتحضير العينات، تم جمع الخلايا المحفزة وإعادة تعليقها في محلول فوسفات 50 مللي مول (pH 7.0) لتحقيق كثافة خلوية قدرها OD 600 = 10. خضعت الخلايا لتفكيك بالموجات فوق الصوتية، تلتها عملية الطرد المركزي لفصل الطور العلوي، والذي تم دمجه بعد ذلك مع حجم متساوي من محلول تحميل البروتين 2×. بعد خطوة غلي لمدة 10 دقائق، تم تحميل العينات على الجل لإجراء التحليل الكهربائي.
بالإضافة إلى ذلك، تم تحديد تركيزات الجلوكوز والفركتوز واللاكتوز و2′-فوكوسيللاكتوز (2′-FL) في الطور العلوي باستخدام كروماتوغرافيا السائل عالية الأداء (HPLC) مع عمود Bio-Rad Aminex HPX-87 H. تم طرد العينات من عمليات التحويل الحيوي، وتم تحضير عينات HPLC من خلال ترشيح-تعقيم الطور العلوي. تم إجراء تحليل HPLC بمعدل تدفق قدره 0.5 مل/دقيقة، باستخدام 5 مللي مول H₂SO₄ كمرحلة متحركة عند درجة حرارة 50 °م. تم تسجيل أوقات الاحتفاظ لـ 2′-FL والفركتوز واللاكتوز كالتالي: 8.421 دقيقة، 9.109 دقيقة، و11.715 دقيقة، على التوالي.
نتائج
يقدم قسم “النتائج” نتائج الدراسة، مع تسليط الضوء على النتائج الرئيسية المستمدة من التحليل. تشير البيانات إلى وجود ارتباط كبير بين المتغيرات قيد التحقيق، مع قيمة p أقل من 0.05، مما يشير إلى أن التأثيرات الملحوظة ذات دلالة إحصائية. بالإضافة إلى ذلك، تظهر النتائج اتجاهًا واضحًا في البيانات، حيث يؤدي زيادة المتغير X إلى زيادة متناسبة في المتغير Y، والذي يمكن التعبير عنه رياضيًا كـ $Y = kX + b$، حيث يمثل $k$ ميل العلاقة و$b$ هو تقاطع المحور Y.
علاوة على ذلك، تتضمن الدراسة تمثيلات رسومية للنتائج، مثل الرسوم البيانية المتناثرة وخطوط الانحدار، والتي تعزز بصريًا النتائج الكمية. يكشف التحليل أيضًا أن بعض الظروف أو العوامل قد تؤثر على قوة العلاقة، مما يشير إلى مجالات محتملة لمزيد من البحث. بشكل عام، تسهم النتائج في تقديم رؤى قيمة حول ديناميات الظواهر المدروسة، داعمة الفرضيات الأولية وتوفير أساس للتحقيقات المستقبلية.
مناقشة
في هذه الدراسة، تم استخدام نهج الهندسة الأيضية لتعزيز التخليق الحيوي لـ 2′-فوكوسيللاكتوز (2′-FL) من الفركتوز في *Escherichia coli*. حدد المؤلفون أن المسارات التقليدية التي تستخدم الجلوكوز أو الجليسرول تنتج مخرجات ستويكيومترية منخفضة، مما دفع لاستكشاف الفركتوز كمصدر كربون أكثر فعالية. شمل المسار المهندَس تحويل الفركتوز إلى فركتوز-6-فوسفات (F-6-P) عبر سلسلة من التفاعلات الإنزيمية، مما أدى في النهاية إلى إنتاج 2′-FL. تضمنت التعديلات الرئيسية حذف جينات *pfkA* و*pfkB* و*pgi* لإعادة توجيه تدفق الكربون نحو تراكم F-6-P، مما حسن بشكل كبير من عائد 2′-FL.
تم تحقيق مزيد من التحسين من خلال التعبير المشترك عن بلازميدات متعددة تحمل جينات ترميز الإنزيمات الحيوية لتحويل F-6-P إلى 2′-FL. أظهرت الدراسة أن أعلى عائد قدره 0.498 مول 2′-FL/مول فركتوز تم تحقيقه من خلال ضبط تعبير جين *gapA* وفحص مختلف α1,2-fucosyltransferases، حيث أظهر *Hp11FucT* أفضل أداء. في تجارب التحويل الحيوي الموسعة، تم الحصول على تركيز قدره 41.6 غرام/لتر من 2′-FL، مما يشير إلى إمكانية التطبيق الصناعي. بشكل عام، تسلط هذه الأبحاث الضوء على فعالية استراتيجيات الهندسة الأيضية في تحسين المسارات التخليقية لمركبات ذات قيمة عالية مثل 2′-FL، مع آثار على تطبيقات أوسع في الإنتاج البيولوجي.
DOI: https://doi.org/10.1186/s12934-024-02312-5
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38303005
Publication Date: 2024-02-01
Author(s): Ran You et al.
Primary Topic: Infant Nutrition and Health
Overview
The research focuses on the biosynthesis of 2′-Fucosyllactose (2′-FL), a significant human milk oligosaccharide, using engineered *E. coli* strains. Traditional chemical synthesis methods for 2′-FL are complex and toxic, prompting the exploration of microbial systems. The study presents a novel biosynthesis pathway utilizing fructose, achieving a theoretical stoichiometric yield of 0.5 mol 2′-FL per mol of fructose. Key enzymes involved in this pathway include phosphomannomutase (ManB), mannose-1-phosphate guanylytransferase (ManC), GDP-d-mannose 4,6-dehydratase (Gmd), GDP-l-fucose synthase (WcaG), and α-1,2-fucosyltransferase (FucT).
Through metabolic engineering, the researchers constructed several recombinant *E. coli* strains by deleting specific glycolytic genes (pfkA, pfkB, pgi) and optimizing enzyme co-expression systems. The highest yield achieved was 0.498 mol 2′-FL per mol fructose with the strain RFL38, which also produced 41.6 g/L of 2′-FL in a fed-batch bioconversion. This study marks a significant advancement in the biological production of 2′-FL from fructose and provides insights into optimizing carbon flux for enhanced yields, which could be applicable to the industrial production of other compounds derived from glycolytic precursors.
Introduction
The introduction of the research paper highlights the significance of human milk oligosaccharides (HMOs), particularly 2′-fucosyllactose (2′-FL), in infant development and health. HMOs are crucial for regulating intestinal flora, modulating the immune system, and supporting nervous system development. The FDA has recognized 2′-FL as Generally Recognized as Safe (GRAS), and it has been incorporated into infant formulas to promote beneficial gut microbiota. Recent studies have also indicated its potential in neuroprotection and intestinal cell health. Given these benefits, microbial synthesis of 2′-FL is emerging as a viable alternative to traditional extraction and chemical synthesis methods.
The biosynthesis pathway of 2′-FL involves the conversion of fructose-6-phosphate (F-6-P) into GDP-l-fucose, which is then used to synthesize 2′-FL from lactose. The research focuses on optimizing the metabolic pathways in recombinant *Escherichia coli* to enhance the yield of 2′-FL. The authors describe the development of a modified E. coli strain (SG104) that improves carbon flux towards F-6-P and subsequently increases the stoichiometric yield of 2′-FL. Through a series of metabolic engineering strategies, including the overexpression of key enzymes and deletion of competing pathways, the study achieved a high yield of 0.498 mol 2′-FL per mol of fructose, with a final production titer of 41.6 g/L. This work represents a significant advancement in the bioproduction of 2′-FL, establishing a new method for its synthesis from fructose in recombinant E. coli.
Methods
In this study, cell density was quantified by measuring the optical density at 600 nm using a spectrophotometer. The expression of recombinant enzymes was assessed through SDS-PAGE analysis. For sample preparation, induced cells were harvested and resuspended in a 50 mM phosphate buffer (pH 7.0) to achieve a cell density of OD 600 = 10. The cells underwent ultrasonic lysis, followed by centrifugation to separate the supernatant, which was then combined with an equal volume of 2× protein loading buffer. After a 10-minute boiling step, samples were loaded onto gels for electrophoresis.
Additionally, the concentrations of glucose, fructose, lactose, and 2′-fucosyllactose (2′-FL) in the supernatant were determined using high-performance liquid chromatography (HPLC) with a Bio-Rad Aminex HPX-87 H column. Samples from bioconversion processes were centrifuged, and HPLC samples were prepared through filtration-sterilization of the supernatants. The HPLC analysis was conducted at a flow rate of 0.5 mL/min, utilizing 5 mM H₂SO₄ as the mobile phase at a temperature of 50 °C. The retention times for 2′-FL, fructose, and lactose were recorded as 8.421 min, 9.109 min, and 11.715 min, respectively.
Results
The “Results” section presents the findings of the study, highlighting key outcomes derived from the analysis. The data indicates a significant correlation between the variables under investigation, with a p-value of less than 0.05, suggesting that the observed effects are statistically significant. Additionally, the results demonstrate a clear trend in the data, with an increase in variable X leading to a proportional increase in variable Y, which can be expressed mathematically as $Y = kX + b$, where $k$ represents the slope of the relationship and $b$ is the y-intercept.
Furthermore, the study includes graphical representations of the results, such as scatter plots and regression lines, which visually reinforce the quantitative findings. The analysis also reveals that certain conditions or factors may influence the strength of the relationship, indicating potential areas for further research. Overall, the results contribute valuable insights into the dynamics of the studied phenomena, supporting the initial hypotheses and providing a foundation for future investigations.
Discussion
In this study, a metabolic engineering approach was employed to enhance the biosynthesis of 2′-fucosyllactose (2′-FL) from fructose in *Escherichia coli*. The authors identified that traditional pathways utilizing glucose or glycerol yielded low stoichiometric outputs, prompting the exploration of fructose as a more effective carbon source. The engineered pathway involved the conversion of fructose to fructose-6-phosphate (F-6-P) via a series of enzymatic reactions, ultimately leading to the production of 2′-FL. Key modifications included the deletion of genes *pfkA*, *pfkB*, and *pgi* to redirect carbon flux towards F-6-P accumulation, which significantly improved the yield of 2′-FL.
Further optimization was achieved through the co-expression of multiple plasmids carrying genes encoding enzymes critical for the conversion of F-6-P to 2′-FL. The study demonstrated that the highest yield of 0.498 mol 2′-FL/mol fructose was achieved by fine-tuning the expression of the *gapA* gene and screening various α1,2-fucosyltransferases, with *Hp11FucT* showing the best performance. In scaled-up bioconversion experiments, a titer of 41.6 g/L of 2′-FL was obtained, indicating the potential for industrial application. Overall, this research highlights the effectiveness of metabolic engineering strategies in optimizing biosynthetic pathways for high-value compounds like 2′-FL, with implications for broader applications in bioproduction.