DOI: https://doi.org/10.1038/s42004-024-01324-x
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39424933
تاريخ النشر: 2024-10-18
المؤلف: Shuang Hao وآخرون
الموضوع الرئيسي: التحليل الكيميائي الحيوي وتقنيات الاستشعار
نظرة عامة
تبحث الدراسة في آليات ارتباط مختلف جليكوسيدات الستيفيول والمحليات الصناعية بمستقبل طعم الحلاوة الهتروثنائي T1R2/T1R3، مع التركيز على أربعة مواقع ارتباط مميزة: مجالات مصيدة فينوس (VFD2، VFD3) والمجالات عبر الغشائية (TMD2، TMD3). يرتبط السكروز بكلا VFDs، مما يوفر الحلاوة والطاقة، بينما ترتبط المحليات غير السعرية مثل السوكراوز وأسبارتام فقط بـ VFD2، مما يؤدي إلى حلاوة شديدة. تستخدم الدراسة تجارب الارتباط والمحاكاة الحاسوبية للكشف عن أن الطرف الكربوكسي C20 من بروتين Gα يمكن أن يتفاعل مع TMD2 أو TMD3، مما يعزز من تقارب GPCR لجليكوسيدات الستيفيول.
تشير النتائج إلى أن التعديلات المختلفة لجليكوسيدات الستيفيول تؤدي إلى مواقع ارتباط مفضلة مختلفة، حيث نجحت المحاكاة الجزيئية في التنبؤ بهذه المواقع لجليكوسيدات معينة (RebC، Rubu، RebM، وRebD). تسلط الدراسة الضوء على دور اقتران بروتين G في تعديل تنشيط المستقبل وتقترح أنه بدون مشاركة بروتين G، قد لا يثبت ارتباط الجزيء شكل المستقبل، مما قد يكشف عن جيوب ارتباط إضافية. توفر هذه التعقيدات في تفاعلات الجزيء-المستقبل أساسًا للدراسات المستقبلية في الإدراك الحسي وتصميم الجزيئات للمحليات غير السعرية، مع آثار على إدارة السمنة واضطرابات الأيض.
الطرق
في هذه الدراسة، تم استخدام طريقتين مستقرتين خاليتين من الخلايا للتحقيق في ارتباط مختلف الجزيئات بمستقبلات طعم الحلاوة. تضمنت الطرق استنفاد الراديوليجاند باستخدام مستقبلات طعم الحلاوة المستنسخة وبروتينات G من خلايا براعم التذوق، وتقنية FLOWER التي تستخدم مستقبلات هتروثنائية مستقرة معبر عنها في خلايا غير متجانسة. تم اختيار مجموعة من الجزيئات، بما في ذلك RebM، Ace-K، RebC، وغيرها، بناءً على خصائص ارتباطها في مواقع محددة على المستقبلات، مثل مجال الطي المتغير (VFD) والمجالات عبر الغشائية (TMD). يتم توصيل طعم الحلاوة بشكل أساسي من خلال ارتباط المحليات بمستقبل الهتروثنائي T1R2/T1R3، حيث ترتبط السكريات الطبيعية بـ VFD وترتبط المحليات ثنائية الببتيد بشكل محدد بـ T1R2.
بالنسبة للإجراءات التجريبية، تم زراعة وحصاد خطوط خلايا براعم التذوق البشرية، تلتها سلسلة من خطوات الطرد المركزي لعزل أغشية الخلايا. تم تجانس الخلايا في محلول عازل وخضعت لطرد مركزي تفاضلي للحصول على راسب غشائي، والذي تم تخزينه لمزيد من التحليل. تم استخدام جزيئات مشعة، مثل [^3H]-Rebaudioside B و [^3H]-Perillartine، لتقييم حركيات الارتباط، جنبًا إلى جنب مع جزيئات غير موسومة كمنافسين، لتوضيح التفاعلات بين المحليات ومستقبلات التذوق.
النتائج
في هذا القسم، يقدم المؤلفون تحليلًا مفصلًا لتفاعلات الارتباط بين الجزيئات الحلوة ومستقبلات T1R2/T1R3، مقسمة إلى ثلاثة مكونات رئيسية: تجارب الارتباط التنافسي للراديوليجاند، تجارب FLOWER، والتحليلات الحاسوبية. كشفت دراسات ارتباط الراديوليجاند، وخاصة باستخدام [^3H]-Rebaudioside B، عن تقارب ارتباط يتميز بثابت معدل قدره $k_{on} = 91.82 \, \text{M}^{-1} \text{min}^{-1}$ وثابت تفكك قدره $K_d = 0.005795 \, \text{M}$. من الجدير بالذكر أن وجود GDP وGTP أعاق ارتباط Rebaudioside B، مع قيم IC50 تبلغ 2.152 مللي مول و9.222 مللي مول، على التوالي. أشارت تجارب المنافسة إلى سلوكيات ارتباط غير متوقعة بين مختلف الجليكوسيدات، مما يشير إلى مواقع ارتباط بديلة محتملة تتجاوز الموقع المفترض VFD2.
قدمت تجارب FLOWER ملاحظات مباشرة على استجابات ارتباط الجزيئات، بينما توقعت التحليلات الحاسوبية طاقات الارتباط وحددت مواقع الارتباط المحتملة من خلال محاكاة الارتباط. تم أيضًا تحديد حركيات جزيئات أخرى، مثل [^3H]-Lactisole و [^3H]-Perillartine، مما كشف عن تقارب الارتباط وتفاعلات غير متوقعة مع جزيئات معروفة. على سبيل المثال، أظهر [^3H]-Lactisole $k_{on} = 217.7 \, \text{M}^{-1} \text{min}^{-1}$ و $K_d = 0.0000669 \, \text{M}$، بينما أظهر [^3H]-Perillartine $k_{on} = 184288 \, \text{M}^{-1} \text{min}^{-1}$ و $K_d = 0.000002896 \, \text{M}$. تشير النتائج إلى أن ديناميات ارتباط الجزيئات الحلوة معقدة، مع آثار لفهم تفاعلات المستقبل-الجزيء في إدراك الطعم. يُوصى بإجراء دراسات مستقبلية لاستكشاف دور اقتران بروتين G والتعديل الألستيري المحتمل باستخدام GTPγS الموسوم.
المناقشة
يتناول قسم المناقشة في ورقة البحث الآليات المعقدة لإدراك طعم الحلاوة، مع التركيز على مواقع الارتباط المتعددة للمحليات على مستقبل T1R2/T1R3. على عكس الافتراض السائد بوجود موقع ارتباط واحد، تكشف النتائج أن الجزيئات الحلوة يمكن أن تتفاعل مع مواقع مختلفة على المستقبل، خاصة في البيئات التي تفتقر إلى اقتران بروتين G. أظهرت تجارب المنافسة في الارتباط أن جزيئات مثل RebB وRebM لا تتنافس على نفس موقع الارتباط، مما يشير إلى أنها تشغل جيوبًا مختلفة ضمن نفس المنطقة. تدعم هذه الملاحظة النتائج الغامضة للارتباط التنافسي بين الجزيئات المفترض أنها تستهدف مجالات متميزة، مما يعزز فرضية وجود مواقع ارتباط متعددة.
تسلط الدراسة أيضًا الضوء على قيود التجارب التقليدية المعتمدة على الخلايا في التقاط التعقيد الكامل لتفاعلات الجزيء-المستقبل، حيث قد تتجاهل هذه الطرق الأحداث الضعيفة أو غير الإشارية. تؤكد محاكاة الديناميات الجزيئية وتحليلات SiteMap وجود تسعة جيوب ارتباط متميزة على المستقبل، والتي يمكن أن توضح حدود القوة للمحليات عالية الكثافة. تفترض الدراسة أن التنشيط يبدأ بارتباط عالي التقارب في موقع أورثوستيري، ولكنه قد يكون مقيدًا من خلال ارتباط لاحق في موقع ألستيري منخفض التقارب، مما يؤدي إلى “تثبيط ذاتي”. بالإضافة إلى ذلك، تناقش الورقة آلية تنشيط الهتروثنائي T1R2/T1R3، مقترحة أن ارتباط المحفز يؤدي إلى تغييرات شكلية تسهل تنشيط بروتين G، على الرغم من أن موقع الاقتران المحدد لا يزال غامضًا تجريبيًا. بشكل عام، توفر النتائج رؤى حاسمة حول ديناميات الارتباط ومسارات التنشيط لمستقبلات طعم الحلاوة، مما يمهد الطريق للتحقيقات المستقبلية في آلياتها الوظيفية.
DOI: https://doi.org/10.1038/s42004-024-01324-x
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39424933
Publication Date: 2024-10-18
Author(s): Shuang Hao et al.
Primary Topic: Biochemical Analysis and Sensing Techniques
Overview
The research investigates the binding mechanisms of various steviol glycosides and artificial sweeteners to the heterodimeric sweet taste receptor T1R2/T1R3, focusing on four distinct binding sites: the Venus flytrap domains (VFD2, VFD3) and transmembrane domains (TMD2, TMD3). Sucrose binds to both VFDs, providing sweetness and energy, while non-caloric sweeteners like sucralose and aspartame bind only to VFD2, resulting in intense sweetness. The study employs binding experiments and computational docking to reveal that the C20 carboxy terminus of the Gα protein can interact with TMD2 or TMD3, enhancing GPCR affinity for steviol glycosides.
The findings indicate that different modifications of steviol glycosides lead to varying preferred binding sites, with molecular docking successfully predicting these sites for specific glycosides (RebC, Rubu, RebM, and RebD). The research highlights the role of G protein coupling in modulating receptor activation and suggests that without G protein involvement, ligand binding may not stabilize the receptor’s conformation, potentially exposing additional binding pockets. This complexity in ligand-receptor interactions provides a foundation for future studies in sensory perception and molecular design of non-caloric sweeteners, with implications for obesity and metabolic disorders management.
Methods
In this study, two cell-free stable heterodimer methods were employed to investigate the binding of various ligands to sweet taste receptors. The methods included radioligand depletion using cloned sweet taste receptors and G proteins from taste bud cells, and the FLOWER technique utilizing stabilized heterodimer receptors expressed in heterologous cells. A range of ligands, including RebM, Ace-K, RebC, and others, were selected based on their binding characteristics at specific sites on the receptors, such as the variable folding domain (VFD) and transmembrane domains (TMD). The sweet taste is primarily mediated by the binding of sweeteners to the heterodimeric receptor T1R2/T1R3, with natural sugars binding to the VFD and dipeptide sweeteners binding specifically to T1R2.
For the experimental procedures, human taste bud cell lines were cultured and harvested, followed by a series of centrifugation steps to isolate the cell membranes. The cells were homogenized in a buffer and subjected to differential centrifugation to obtain a membrane pellet, which was then stored for further analysis. Radioactive ligands, such as [^3H]-Rebaudioside B and [^3H]-Perillartine, were utilized to assess binding kinetics, alongside non-labeled ligands as competitors, to elucidate the interactions between sweeteners and taste receptors.
Results
In this section, the authors present a detailed analysis of the binding interactions between sweet ligands and the T1R2/T1R3 receptors, structured into three primary components: radioligand competitive binding assays, FLOWER experiments, and in silico analyses. The radioligand binding studies, particularly using [^3H]-Rebaudioside B, revealed a binding affinity characterized by a rate constant of $k_{on} = 91.82 \, \text{M}^{-1} \text{min}^{-1}$ and a dissociation constant of $K_d = 0.005795 \, \text{M}$. Notably, the presence of GDP and GTP inhibited Rebaudioside B binding, with IC50 values of 2.152 mM and 9.222 mM, respectively. Competition assays indicated unexpected binding behaviors among various rebaudiosides, suggesting potential alternative binding sites beyond the presumed VFD2 site.
The FLOWER experiments provided direct observations of ligand binding responses, while the in silico analyses predicted binding energies and identified potential binding sites through docking simulations. The kinetics of other ligands, such as [^3H]-Lactisole and [^3H]-Perillartine, were also characterized, revealing binding affinities and unexpected interactions with known ligands. For instance, [^3H]-Lactisole exhibited a $k_{on} = 217.7 \, \text{M}^{-1} \text{min}^{-1}$ and a $K_d = 0.0000669 \, \text{M}$, while [^3H]-Perillartine showed a $k_{on} = 184288 \, \text{M}^{-1} \text{min}^{-1}$ and a $K_d = 0.000002896 \, \text{M}$. The findings suggest that the binding dynamics of sweet ligands are complex, with implications for understanding receptor-ligand interactions in taste perception. Future studies are recommended to explore the role of G protein coupling and potential allosteric modulation using labeled GTPγS.
Discussion
The discussion section of the research paper delves into the intricate mechanisms of sweet taste perception, emphasizing the multiple binding sites of sweeteners on the T1R2/T1R3 receptor. Contrary to the prevailing assumption of a singular binding site, the findings reveal that sweet ligands can interact with various sites on the receptor, particularly in environments devoid of G protein coupling. Binding competition experiments demonstrated that ligands like RebB and RebM do not compete for the same binding site, suggesting they occupy different pockets within the same region. This observation is further supported by ambiguous competitive binding results among ligands presumed to target distinct domains, reinforcing the hypothesis of multiple binding sites.
The study also highlights the limitations of traditional cell-based assays in capturing the full complexity of ligand-receptor interactions, as these methods may overlook weaker or non-signaling binding events. Molecular dynamics simulations and SiteMap analyses corroborate the existence of nine distinct binding pockets on the receptor, which could elucidate the potency limits of high-intensity sweeteners. The research posits that activation begins with high-affinity binding at an orthosteric site but may be constrained by subsequent binding at a lower-affinity allosteric site, leading to “auto-antagonism.” Additionally, the paper discusses the activation mechanism of the T1R2/T1R3 heterodimer, suggesting that agonist binding induces conformational changes that facilitate G protein activation, although the specific coupling site remains experimentally ambiguous. Overall, the findings provide critical insights into the binding dynamics and activation pathways of sweet taste receptors, paving the way for future investigations into their functional mechanisms.