DOI: https://doi.org/10.1021/acs.jproteome.3c00671
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38691771
تاريخ النشر: 2024-05-01
المؤلف: Christa P. Baker وآخرون
الموضوع الرئيسي: تقنيات البروتيوميات المتقدمة وتطبيقاتها
نظرة عامة
في هذا القسم، يناقش المؤلفون التقدم في تقنيات الاكتساب المستقل عن البيانات (DIA) التي تعزز من تحليل البروتيوم، وخاصة من خلال تحسين معلمات البحث في Spectronaut. يظهرون أنه من خلال ضبط هذه المعلمات بدقة، يمكن تقليل حدوث الإيجابيات الكاذبة بشكل كبير، وهو أمر حاسم مع توسع تغطية البروتيوم. باستخدام نموذج عدوى مناعية مع ماكروفاجات Mus musculus، قارن الباحثون بين بروتيومات الماكروفاجات غير المصابة وتلك التي تم إضافتها مع Candida albicans. سمح هذا الإعداد بتحديد الإيجابيات الكاذبة، حيث لم يكن من المتوقع وجود ببتيدات وبروتينات Candida في عينات Mus musculus فقط.
تشير النتائج إلى أن تحسين معلمات البحث أدى إلى تقليل بنسبة 89% في تحديد الإيجابيات الكاذبة على كل من مستوى الببتيد والبروتين، مما يعزز جودة البيانات. من المهم أن هذا التحسين أدى إلى انخفاض طفيف في تحديد الإيجابيات الحقيقية، مع تقليل أقل من 6.7% عبر النسخ البيولوجية. يؤكد المؤلفون أن هذه المعلمات المحسنة لها تطبيقات أوسع، مما يفيد أي تجارب DIA تتضمن تجمعات خلوية أو أنسجة غير متجانسة.
مقدمة
تناقش مقدمة هذه الورقة البحثية التقدم في الاكتساب المستقل عن البيانات (DIA) لعلوم البروتيوميات على نطاق واسع، وخاصة في سياق تحليل عينات بيولوجية معقدة تشمل أنواع متعددة. على عكس الاكتساب المعتمد على البيانات (DDA)، يقوم DIA بتفتيت جميع الأيونات ضمن نافذة معينة من الكتلة إلى الشحنة (M/Z)، مما يؤدي إلى طيف أكثر تعقيدًا. كانت الاعتماد الأولي على توليد المكتبات لتحليل DIA يطرح تحديات بسبب قيود الوقت والتكلفة، مما أدى إلى تطوير سير العمل الخالي من المكتبات الذي أصبح معيارًا في الدراسات البروتيومية الشاملة. تتناول هذه الورقة بشكل خاص التحديات المرتبطة بتحليل بروتيومات ماكروفاجات Mus musculus (M. musculus) في وجود العامل الممرض الانتهازي Candida albicans (C. albicans)، مع تسليط الضوء على التعقيدات التي أدت إليها التشابه التسلسلي بين الأنواع.
حقق المؤلفون في تأثير إعدادات Spectronaut المختلفة على تحديد الإيجابيات الكاذبة في عينات تحتوي على مستخلصات من نوع أو نوعين. كشفت نتائجهم أن سير العمل الخالي من المكتبات باستخدام directDIA مع الإعدادات الافتراضية أدى إلى تحديد غير صحيح لأكثر من 1,000 ببتيد من C. albicans في عينات M. musculus غير المضافة. من خلال تحسين معلمات البحث، قللوا بشكل كبير من التحديدات الخاطئة مع الحفاظ على تغطية البروتيوم. بشكل محدد، أدى ضبط احتمال الخطأ اللاحق ودرجات q-value للبروتين إلى تقليل عدد ببتيدات C. albicans المحددة من 1,514 إلى 164، مع تأثير طفيف على تحديد بروتيوم M. musculus. أظهرت الإعدادات المحسنة استراتيجية قوية لتعزيز جودة البيانات في التحليلات متعددة الأنواع، مما يحسن في النهاية موثوقية التفسيرات البيولوجية في الدراسات البروتيومية.
طرق
في القسم التجريبي من الدراسة، تم إجراء جميع الأعمال الحيوانية في جامعة دندي، مع الالتزام برخصة مكتب الداخلية في المملكة المتحدة (PAAE38C7B) والحصول على موافقة من لجنة المراجعة الأخلاقية والرفاهية. تم الحصول على فئران C57Bl6/J من مختبرات تشارلز ريفر، المملكة المتحدة، وتم إيواؤها في بيئة خالية من مسببات الأمراض المحددة داخل أقفاص ذات تهوية فردية. تم الحفاظ على الفئران في مجموعات من نفس الجنس، وتم تزويدها بالطعام (R&M1 SDS، خدمات النظام الغذائي الخاص) والماء، وتم الاحتفاظ بها تحت ظروف خاضعة للرقابة لدورة ضوء/ظلام مدتها 12 ساعة عند 21 درجة مئوية مع رطوبة تتراوح بين 45-65%.
تم التخلص من الفئران باستخدام زيادة التعرض لثاني أكسيد الكربون في أقفاصها، تلاها تأكيد الوفاة من خلال الانزلاق العنقي. ضمنت هذه المنهجية الامتثال للمعايير الأخلاقية مع توفير بيئة خاضعة للرقابة للدراسة.
نتائج
يقدم قسم “النتائج” في الورقة البحثية النتائج الرئيسية المستمدة من التجارب أو التحليلات التي تم إجراؤها. عادةً ما يتضمن بيانات كمية، وتحليلات إحصائية، وتمثيلات بصرية مثل الرسوم البيانية أو الجداول التي توضح نتائج الدراسة. غالبًا ما تتم مقارنة النتائج مع الفرضيات أو التوقعات الأولية، مع تسليط الضوء على الأنماط أو الارتباطات أو التناقضات الملحوظة خلال البحث.
في هذا القسم، قد يناقش المؤلفون أيضًا تداعيات نتائجهم، مع التأكيد على كيفية مساهمتها في المعرفة الحالية في هذا المجال. بالإضافة إلى ذلك، قد يتم الاعتراف بأي قيود واجهت خلال الدراسة وتأثيرها المحتمل على النتائج، مما يوفر فهمًا شاملاً لنتائج البحث.
مناقشة
في هذه الدراسة، حقق المؤلفون في تعقيدات تحليل البروتيومات من نوعين متميزين، Mus musculus (M. musculus) وCandida albicans (C. albicans)، باستخدام قياس الطيف الكتلي المستقل عن البيانات (DIA). قاموا بزراعة ماكروفاجات مشتقة من نخاع العظام (BMDMs) من الفئران وC. albicans، تلاها التحلل والتحليل البروتيومي. أشارت النتائج إلى مستوى منخفض من التشابه التسلسلي بين النوعين، مع تحديد 351 ببتيد عبر الأنواع، مما يشير إلى خطر ضئيل من الخطأ في التعريف. ومع ذلك، كشفت التحليلات أن عددًا كبيرًا من ببتيدات C. albicans تم اكتشافها في عينات الفئران غير المضافة، مما أثار مخاوف بشأن الإيجابيات الكاذبة بسبب انتقال الببتيدات عبر التجارب.
لمعالجة هذه القضايا، قام المؤلفون بتحسين معلمات البحث لتعزيز صرامة التعريف، مما أدى إلى تقليل بنسبة 90% في الإيجابيات الكاذبة مع تقليل طفيف فقط في العدد الإجمالي لتحديدات ببتيدات M. musculus الحقيقية. تؤكد هذه الأعمال على أهمية تحسين الأساليب التحليلية في البروتيوميات، خاصة في الدراسات التي تشمل تجمعات غير متجانسة. تدعو النتائج إلى تحويل التركيز من مجرد زيادة التحديدات إلى تحسين جودة تلك التحديدات، مما قد يكون مفيدًا لمجموعة متنوعة من التطبيقات في الأبحاث المناعية ومتعددة الأنواع.
DOI: https://doi.org/10.1021/acs.jproteome.3c00671
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38691771
Publication Date: 2024-05-01
Author(s): Christa P. Baker et al.
Primary Topic: Advanced Proteomics Techniques and Applications
Overview
In this section, the authors discuss advancements in data-independent acquisition (DIA) techniques that enhance proteome profiling, particularly through the optimization of search parameters in Spectronaut. They demonstrate that by fine-tuning these parameters, the incidence of false positives can be significantly reduced, which is crucial as proteome coverage expands. Utilizing an immunological infection model with Mus musculus macrophages, the researchers compared the proteomes of uninfected macrophages to those spiked with Candida albicans. This setup allowed for the identification of false positives, as the presence of Candida peptides and proteins in Mus musculus-only samples was not expected.
The results indicate that optimizing search parameters led to an 89% reduction in false positive identifications at both the peptide and protein levels, thereby enhancing data quality. Importantly, this optimization resulted in a minimal decrease in true positive identifications, with a reduction of less than 6.7% across biological replicates. The authors assert that these improved search parameters have broader applicability, benefiting any DIA experiments that involve heterogeneous cell populations or tissues.
Introduction
The introduction of this research paper discusses the advancements in data-independent acquisition (DIA) for large-scale proteomics, particularly in the context of analyzing complex biological samples involving multiple species. Unlike data-dependent acquisition (DDA), DIA fragments all ions within a specific mass-to-charge (M/Z) window, resulting in more complex spectra. The initial reliance on library generation for DIA analysis posed challenges due to time and cost constraints, leading to the development of library-free workflows that have since become standard in comprehensive proteomic studies. This paper specifically addresses the challenges of analyzing the proteomes of Mus musculus (M. musculus) macrophages in the presence of the opportunistic pathogen Candida albicans (C. albicans), highlighting the complications introduced by sequence homology between species.
The authors investigated the impact of various Spectronaut settings on the identification of false positives in samples containing lysates from one or two species. Their findings revealed that a library-free workflow using directDIA with default settings led to the incorrect identification of over 1,000 C. albicans peptides in nonspiked M. musculus samples. By optimizing search parameters, they significantly reduced false identifications while maintaining proteome coverage. Specifically, adjusting the posterior error probability and protein q-value scores led to a reduction in identified C. albicans peptides from 1,514 to 164, with a minimal impact on M. musculus proteome identification. The optimized settings demonstrated a robust strategy for enhancing data quality in multispecies analyses, ultimately improving the reliability of biological interpretations in proteomic studies.
Methods
In the experimental section of the study, all animal work was conducted at the University of Dundee, adhering to the UK Home Office license (PAAE38C7B) and receiving approval from the Ethical Review and Welfare Committee. C57Bl6/J mice were sourced from Charles River Laboratories, UK, and were housed in a specific pathogen-free environment within individually ventilated cages. The mice were maintained in same-sex groups, provided with food (R&M1 SDS, Special Diet Services) and water, and were kept under controlled conditions of a 12-hour light/dark cycle at 21 °C with 45-65% humidity.
Culling of the mice was performed using increased CO₂ exposure in their cages, followed by confirmation of death through cervical dislocation. This methodology ensured compliance with ethical standards while providing a controlled environment for the study.
Results
The “Results” section of the research paper presents the key findings derived from the conducted experiments or analyses. It typically includes quantitative data, statistical analyses, and visual representations such as graphs or tables that illustrate the outcomes of the study. The results are often compared against the initial hypotheses or expectations, highlighting significant patterns, correlations, or discrepancies observed during the research.
In this section, the authors may also discuss the implications of their findings, emphasizing how they contribute to the existing body of knowledge in the field. Additionally, any limitations encountered during the study and their potential impact on the results may be acknowledged, providing a comprehensive understanding of the research outcomes.
Discussion
In this study, the authors investigated the complexities of analyzing proteomes from two distinct species, Mus musculus (M. musculus) and Candida albicans (C. albicans), using data-independent acquisition (DIA) mass spectrometry. They cultured bone marrow-derived macrophages (BMDMs) from mice and C. albicans, followed by lysis and proteomic analysis. The results indicated a low level of sequence homology between the two species, with only 351 cross-species peptides identified, suggesting minimal risk of misidentification. However, the analysis revealed that a significant number of C. albicans peptides were detected in nonspiked murine samples, raising concerns about false positives due to peptide transfer across runs.
To address these issues, the authors optimized search parameters to enhance identification stringency, resulting in a 90% reduction in false positives while only slightly decreasing the total number of true M. musculus peptide identifications. This work underscores the importance of refining analytical methods in proteomics, particularly in studies involving heterogeneous populations. The findings advocate for a shift in focus from merely maximizing identifications to improving the quality of those identifications, which could be beneficial for various applications in immunological and multi-species research.