DOI: https://doi.org/10.1038/s41592-024-02325-3
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38965443
تاريخ النشر: 2024-07-04
المؤلف: Yue You وآخرون
الموضوع الرئيسي: علم النسخ الجيني أحادي الخلية والمكاني
الطرق
في هذا القسم، يقوم المؤلفون بتقييم منهجيات النسخ الجيني المكاني (sST) بشكل منهجي، مع التركيز على استراتيجيات الفهرسة المكانية المختلفة، بما في ذلك الميكروأري، والتقنيات المعتمدة على الكريات، وتقنيات بولوني/نانوبول، والميكروفلويديك. تستخدم الدراسة أنسجة مرجعية محددة جيدًا: دماغ الفأر البالغ، جنين الفأر E12.5، وبصلة الشم في الفأر البالغ، والتي تظهر خصائص مورفولوجية مميزة وملفات تعبير غير متجانسة. تم تقييم ما مجموعه 11 طريقة sST عبر 35 تجربة، مع توفير بروتوكولات مفصلة لضمان إمكانية التكرار. أنشأ المؤلفون خط أنابيب قياسي للتقييم لمعالجة البيانات المتجانسة، مما يولد رموزًا مكانية وملفات تعبير للمقارنة.
تكشف النتائج أن طرقًا مثل Stereo-seq وBMKMANU S1000 وSalus حققت دقة مكانية عالية، حيث التقطت تقريبًا كامل الدماغ الأيمن وعينات E12.5. ومن الجدير بالذكر أن Visium (probe) وSlide-seq V2 وDynaSpatial أظهرت أعلى حساسية في الحصين، بينما أظهرت Visium (polyA) انحيازات منهجية خاصة بالجينات، خاصة بالنسبة للجينات المتعلقة بالعدسة مثل Crybb3 وCryaa. أظهرت تقييمات الحساسية عبر طبقات مختلفة من بصلة الشم في الفأر أن PIXEL-seq كانت لديها أعلى حساسية، في حين أظهرت HDST أدنى حساسية. تؤكد النتائج على أهمية اختيار الطريقة بناءً على الدقة والحساسية لالتقاط ملفات التعبير الجيني بدقة عبر أنسجة مختلفة.
النتائج
في هذا القسم، يقدم المؤلفون نتائج تحليلهم لطرق التجميع المطبقة على بيانات النسخ الجيني المكاني (sST) من مناطق العين. قاموا بتقييم ثلاثة نهج للتجميع: Seurat، الذي يركز فقط على ملفات النسخ الجيني، وDR.SC وPRECAST، اللذان يدمجان المعلومات المكانية. تشير النتائج إلى أن Seurat تفوقت باستمرار على الطرق الأخرى في تحديد مجموعات الخلايا المتوقعة، خاصة في مجموعات البيانات مثل Slide-seq V2 وStereo-seq، التي التقطت جميع المجموعات المتوقعة بشكل فعال. في المقابل، واجهت بيانات BMKMANU S1000 صعوبة في الكشف عن حالة الخلايا، خاصة بالنسبة للخلايا الصبغية، على الأرجح بسبب انتشار جانبي كبير يؤثر على دقة التجميع.
استكشف المؤلفون أيضًا تأثير تقليل العينة على نتائج التجميع، كاشفين أنه بينما يمكن للبيانات المخفضة أن تكشف تقريبًا عن جميع مجموعات الخلايا المحددة في مجموعات البيانات الكاملة، تم ملاحظة عدم اتساق في نقاء ودقة المجموعات. كانت هذه عدم الاتساق واضحة بشكل خاص بين مجموعات خلايا الشبكية العصبية المرتبطة عن كثب. علاوة على ذلك، أظهرت المقارنات بين بيانات sST وبيانات تسلسل RNA أحادي النواة (snRNA-seq) أنه بينما كانت بعض تعبيرات الجينات متسقة عبر مجموعات بيانات sST، كانت بيانات snRNA-seq تلتقط عددًا أقل من الخلايا، مما يحد من تصنيف المجموعات الفرعية بالتفصيل. أدى دمج بيانات snRNA-seq مع بيانات sST باستخدام Seurat إلى تحسين التوصيفات، خاصة لأنواع الخلايا الصعبة، مع تسليط الضوء على قابلية تقنيات sST للتلوث بالدم، مع مستويات تأثير متباينة عبر طرق مختلفة.
المناقشة
في هذه الدراسة، قمنا بتقييم كفاءة وحساسية طرق النسخ الجيني المكاني (sST) المختلفة باستخدام الحصين وأنسجة العين من الفئران البالغة والأجنة E12.5. أنشأنا إطار عمل منهجي للتقييم، يُشار إليه باسم cadasSTre، لمقارنة 11 تقنية sST مختلفة عبر 35 تجربة. تشير نتائجنا إلى أن أيًا من عمليات التسلسل لم تصل إلى التشبع، مما يشير إلى أن طرق sST تتطلب عددًا أكبر بكثير من القراءات لتحقيق أداء مثالي. من الجدير بالذكر أن Stereo-seq أظهرت أعلى عدد إجمالي في كلا نوعي الأنسجة، بينما أظهرت Visium (المعتمدة على البروبة) كفاءة أعلى في التقاط القراءات في العين. ومع ذلك، عند التحكم في عمق التسلسل، أظهرت Slide-seq V2 حساسية أعلى في العين، بينما كانت Visium وDynaSpatial أفضل أداء في الحصين. تسلط هذه النتائج الضوء على أهمية اختيار الطريقة بناءً على الأسئلة البيولوجية المحددة والحاجة إلى التوحيد في تقييم تقنيات sST.
بالإضافة إلى ذلك، قمنا بتقييم الدقة المكانية لاكتشاف mRNA من خلال تحليل انتشار الجزيئات الجانبي. كشفت تحليلاتنا أن Stereo-seq أظهرت مشاكل ملحوظة في الانتشار الجانبي، بينما حافظت Slide-seq V2 وBMKMANU S1000 على تحكم أفضل في الانتشار. كان تأثير وقت النفاذية على أنماط الانتشار أيضًا كبيرًا، مما يشير إلى أن تحسين هذه المعلمة أمر حاسم لتحسين أداء الاختبار. بشكل عام، تؤكد دراستنا على تعقيدات تقييم طرق sST مقارنة بتسلسل RNA أحادي الخلية، مما يبرز ضرورة التقييم المستمر مع تطور هذا المجال. نهدف إلى توفير قاعدة بيانات شاملة عبر الإنترنت لتسهيل الأبحاث المستقبلية والتعاون في مجال النسخ الجيني المكاني.
DOI: https://doi.org/10.1038/s41592-024-02325-3
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38965443
Publication Date: 2024-07-04
Author(s): Yue You et al.
Primary Topic: Single-cell and spatial transcriptomics
Methods
In this section, the authors systematically benchmark various spatial transcriptomics (sST) methods, focusing on different spatial indexing strategies, including microarray, bead-based, polony/nanoball-based technologies, and microfluidics. The study utilizes well-defined reference tissues: the adult mouse brain, E12.5 mouse embryo, and adult mouse olfactory bulb, which exhibit distinct morphological characteristics and heterogeneous expression profiles. A total of 11 sST methods were evaluated across 35 experiments, with detailed protocols provided to ensure reproducibility. The authors established a standard benchmarking pipeline for homogeneous data processing, generating spatial barcodes and expression profiles for comparison.
The findings reveal that methods such as Stereo-seq, BMKMANU S1000, and Salus achieved high spatial resolution, capturing nearly the entire right brain and E12.5 samples. Notably, Visium (probe), Slide-seq V2, and DynaSpatial demonstrated the highest sensitivity in the hippocampus, while Visium (polyA) exhibited systematic gene-specific biases, particularly for lens-related genes like Crybb3 and Cryaa. Sensitivity assessments across different layers of the mouse olfactory bulb indicated that PIXEL-seq had the highest sensitivity, contrasting with HDST, which showed the lowest. The results underscore the importance of method selection based on resolution and sensitivity to accurately capture gene expression profiles across various tissues.
Results
In this section, the authors present the results of their analysis on clustering methods applied to spatial transcriptomics (sST) data from eye regions. They evaluated three clustering approaches: Seurat, which focuses solely on transcriptomic profiles, and DR.SC and PRECAST, which incorporate spatial information. The findings indicate that Seurat consistently outperformed the other methods in identifying expected cell subsets, particularly in datasets such as Slide-seq V2 and Stereo-seq, which effectively captured all anticipated subsets. In contrast, the BMKMANU S1000 data struggled with cell state detection, especially for melanocytes, likely due to significant lateral diffusion affecting clustering accuracy.
The authors also explored the impact of downsampling on clustering results, revealing that while downsampled data could detect nearly all cell subsets identified in full datasets, inconsistencies in cluster purity and accuracy were noted. This inconsistency was particularly evident among closely related neuronal retina cell subsets. Furthermore, comparisons between sST data and single-nucleus RNA sequencing (snRNA-seq) data showed that while certain gene expressions were consistently patterned across sST datasets, snRNA-seq data captured fewer cells, limiting detailed subgroup categorization. The integration of snRNA-seq data with sST data using Seurat improved annotations, particularly for challenging cell types, while highlighting the susceptibility of sST technologies to blood contamination, with varying levels of impact across different methods.
Discussion
In this study, we evaluated the efficiency and sensitivity of various spatial transcriptomic (sST) methods using hippocampus and eye tissues from adult mice and E12.5 embryos. We established a systematic benchmarking framework, referred to as cadasSTre, to compare 11 different sST technologies across 35 experiments. Our findings indicate that none of the sequencing runs reached saturation, suggesting that sST methods require significantly more reads for optimal performance. Notably, Stereo-seq exhibited the highest total counts in both tissue types, while Visium (probe-based) showed superior read-capturing efficiency in the eye. However, when controlling for sequencing depth, Slide-seq V2 demonstrated higher sensitivity in the eye, whereas Visium and DynaSpatial performed better in the hippocampus. These results highlight the importance of method selection based on specific biological questions and the need for standardization in evaluating sST technologies.
Additionally, we assessed the spatial accuracy of mRNA detection by analyzing molecule lateral diffusion. Our analysis revealed that Stereo-seq exhibited notable lateral diffusion issues, while Slide-seq V2 and BMKMANU S1000 maintained better control over diffusion. The impact of permeabilization time on diffusion patterns was also significant, indicating that optimization of this parameter is crucial for improving assay performance. Overall, our study underscores the complexities of evaluating sST methods compared to single-cell RNA sequencing, emphasizing the necessity for ongoing benchmarking as the field evolves. We aim to provide a comprehensive online database to facilitate future research and collaboration in spatial transcriptomics.