DOI: https://doi.org/10.1038/s41431-025-01995-7
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41588148
تاريخ النشر: 2026-01-26
المؤلف: Alejandro Soriano-Sexto وآخرون
الموضوع الرئيسي: علم الجينوم والأمراض النادرة
نظرة عامة
تستكشف هذه الدراسة تطبيق تسلسل القراءة الطويلة (LRS) لتشخيص الأمراض الأيضية الوراثية النادرة (IMD) التي لا تزال غير محسومة على الرغم من التقدم في تسلسل الجيل التالي. من خلال استهداف جينات معينة (FARS2، GYS2، PEX1، SLC2A1، AGL، ACAT1، وACADM) في سبعة مرضى، حدد الباحثون ستة متغيرات مسببة جديدة، بما في ذلك متغيرين داخل الجين، ومتغير هيكلي، وثلاث إدخالات لعناصر قابلة للنقل (TE). ومن الجدير بالذكر أن الدراسة كشفت أيضًا أن متغيرًا خارج الجين تم تصنيفه سابقًا على أنه خطأ في الشيفرة يؤثر على الربط.
تم تطوير اختبارات جينية وظيفية، مثل تحليل الجينات الصغيرة واختبارات التقاط تكوين الكروماتين، لتقييم تأثير المتغيرات ذات الأهمية غير المؤكدة. من بين إدخالات TE، وُجد أن اثنين منها يقللان من تعبير mRNA لجينات GYS2 وPEX1، بينما الثالث، الذي يقع على بعد 7.6 كيلوبايت أسفل SLC2A1، عطل التفاعل بين محفز SLC2A1 وعنصره التنظيمي البعيد، مما شكل حلقة مع الطرف 3′ من المجال المرتبط طوبولوجيًا الأصلي. بشكل عام، يعزز دمج LRS مع الاختبارات الوظيفية بشكل كبير فهم المشهد الطفري في IMD، مما يحسن القدرات التشخيصية لهذه المجموعة الصعبة من الأمراض النادرة.
مقدمة
تناقش مقدمة هذه الورقة البحثية الأمراض الأيضية الوراثية (IMD)، وهي مجموعة من حوالي 2000 اضطراب تعتبر شائعة نسبيًا وعادة ما يتم تشخيصها من خلال تحليل علامات حيوية في فحص حديثي الولادة أو عند ظهور الأعراض. المعيار الذهبي الحالي للاختبار الجيني هو تسلسل الجيل التالي (NGS)، وخاصة تسلسل الإكسوم (ES)، الذي، على الرغم من انتشاره، يترك العديد من الحالات غير مشخصة. يبرز المؤلفون الحاجة إلى تقنيات إضافية يمكن أن تلتقط طيفًا أوسع من التغيرات الجينية، خاصة تلك الموجودة في المناطق غير المشفرة التي يمكن أن تؤثر على تنظيم الجينات من خلال العناصر التنظيمية الساكنة (CRE) والمجالات المرتبطة طوبولوجيًا (TADs).
تم الإشارة إلى قيود تسلسل الجينوم قصير القراءة (srGS)، وخاصة عدم قدرته على اكتشاف بعض المتغيرات الهيكلية (SV) وتوسعات التكرار المتتالي (TREs) بسبب قصر طول القراءة. بالمقابل، يوفر تسلسل القراءة الطويلة (LRS) مزايا من خلال تمكين رسم خرائط المناطق المتكررة وحل التغيرات الهيكلية بدقة النوكليوتيدات، بينما يقضي أيضًا على تحيز PCR. تؤكد الورقة على دور العناصر القابلة للنقل (TE) في الجينوم البشري وإمكاناتها في المساهمة في الأمراض من خلال آليات متنوعة. لمعالجة الفجوة التشخيصية في IMD، يقترح المؤلفون نهجًا جديدًا يجمع بين LRS المستهدف في مواقع معينة مع اختبارات وظيفية واستقلابية، مستفيدين من ملف التعريف الأيضي لتعزيز الفائدة السريرية.
الطرق
في هذه الدراسة، تم الحصول على الخلايا الليفية من خزعات الجلد للمشاركين، باستثناء المشارك P2، الذي تم استخدام خزعة كبدية له. تم الحفاظ على ثقافات الخلايا الليفية في وسط أساسي أدنى (MEM) معزز بـ 10% مصل جنين العجل، و1% جلوتامين، ومضادات حيوية (100,000 وحدة/لتر من البنسلين و100 ملغ/ديسيلتر من الستربتوميسين). تم احتضان الثقافات تحت ظروف محكومة، تحديدًا عند 37 درجة مئوية في بيئة رطبة مع 5% CO₂ لضمان النمو الأمثل وحيوية الخلايا.
النتائج
في هذه الدراسة، تم تقييم سبعة مشاركين لديهم مؤشرات سريرية و/أو حيوية كيميائية لاضطرابات أيضية وراثية (IMDs). شملت التشخيصات المحتملة نقص الفسفرة المؤكسدة المركبة (MIM#614946)، وأمراض تخزين الجليكوجين (MIM#240600/MIM#232400)، واضطراب تكوين البيروكسيسوم (MIM#214100)، ومتلازمة نقص الناقل الجلوكوز 1 (GLUT1-DS؛ MIM#606777)، وحمض ألفا ميثيل أسيتو أسيتك (MIM#203750)، ونقص إنزيم أسيل-CoA ديهيدروجيناز متوسط السلسلة (MIM#201450). جميع الحالات، باستثناء GLUT1-DS، تتبع نمط وراثي متنحي جسدي.
كشف تحليل تسلسل الإكسوم (ES) عن متغير مسبب هجين في ستة مشاركين، مع وجود خمسة متغيرات تقع في مناطق خارج الجين وواحد في منطقة داخل الجين، جميعها مرتبطة بالوراثة المتنحية الجسدية. ومن الجدير بالذكر أنه لم يتم تحديد أي متغيرات مسببة في المشارك المشتبه في إصابته بـ GLUT1-DS. بينما كانت جميع المتغيرات المحددة موثقة سابقًا في قاعدة بيانات طفرات الجينات البشرية (HGMD، 2025 v3)، كان المتغير ACAT1 NM_000019.4:c.841G>A اكتشافًا جديدًا. على الرغم من هذه التحليلات الجينية، ظلت الحالات السريرية غير محسومة.
المناقشة
في هذه الدراسة، استخدم المؤلفون نهجًا شاملاً يجمع بين دراسات RNA، وتسلسل القراءة الطويلة (LRS)، وعلم الجينوم الوظيفي للتحقيق في المتغيرات الجينية المرتبطة بالاضطرابات الأيضية الوراثية (IMDs). كشفت استخراج وتحليل RNA عن عيوب ترانسكرپشنية كبيرة، بما في ذلك تخطي الإكسون والتعبير المحدد للأليل (ASE) في عدة جينات، مثل FARS2، GYS2، AGL، وACADM. ومن الجدير بالذكر أن الدراسة حددت متغيرات جديدة، بما في ذلك التكرارات المتتالية وإدخالات العناصر القابلة للنقل (TE)، التي تم الإشارة إليها في الربط الشاذ الملحوظ وتقليل التعبير الجيني. تشير النتائج إلى أن إدخالات TE يمكن أن تعطل تنظيم الجينات، مما يبرز دورها المحتمل كعوامل مسببة للأمراض في IMDs.
سمح نهج LRS بالكشف عن المتغيرات الهيكلية (SVs) والمتغيرات غير المشفرة التي قد تفوتها طرق التسلسل التقليدية قصيرة القراءة. أظهرت الدراسة أن هذه المتغيرات يمكن أن تؤثر بشكل كبير على التعبير الجيني وأنماط الربط، مما يساهم في ظواهر الأمراض. علاوة على ذلك، أكد المؤلفون على أهمية إعادة تقييم البيانات الجينومية الحالية لضمان عدم تجاهل المتغيرات المسببة، خاصة في سياق الاضطرابات الوراثية المتنحية. بشكل عام، تؤكد النتائج على فائدة دمج بيانات متعددة الأوميات لتعزيز دقة التشخيص للأمراض الأيضية الوراثية، كاشفة عن طيف أوسع من المتغيرات المسببة للأمراض وتدعو إلى دمج تقنيات التسلسل المتقدمة في الإعدادات السريرية.
DOI: https://doi.org/10.1038/s41431-025-01995-7
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41588148
Publication Date: 2026-01-26
Author(s): Alejandro Soriano-Sexto et al.
Primary Topic: Genomics and Rare Diseases
Overview
This study investigates the application of long-read sequencing (LRS) to diagnose rare inherited metabolic diseases (IMD) that remain unresolved despite advancements in next-generation sequencing. Targeting specific genes (FARS2, GYS2, PEX1, SLC2A1, AGL, ACAT1, and ACADM) in seven patients, the researchers identified six novel pathogenic variants, including two intronic variants, a structural variant, and three insertions of transposable elements (TE). Notably, the study also revealed that an exonic variant previously classified as missense affects splicing.
Functional genetic tests, such as minigenes analysis and chromatin conformation capture assays, were developed to assess the impact of variants of uncertain significance. Among the TE insertions, two were found to reduce mRNA expression of GYS2 and PEX1, while the third, located 7.6 kb downstream of SLC2A1, disrupted the interaction between the SLC2A1 promoter and its distal regulatory element, forming a loop with the 3′ end of the native topologically associating domain. Overall, the integration of LRS with functional assays significantly enhances the understanding of the mutational landscape in IMD, thereby improving diagnostic capabilities for this challenging group of rare diseases.
Introduction
The introduction of this research paper discusses inherited metabolic diseases (IMD), a group of nearly 2000 disorders that are relatively common and typically diagnosed through biochemical marker analysis in newborn screening or upon symptom manifestation. The current gold standard for genetic testing is next-generation sequencing (NGS), particularly exome sequencing (ES), which, despite its prevalence, leaves many cases undiagnosed. The authors highlight the need for additional technologies that can capture a broader spectrum of genetic variations, especially those in non-coding regions that can affect gene regulation through cis-regulatory elements (CRE) and topologically associating domains (TADs).
The limitations of short-read genome sequencing (srGS) are noted, particularly its inability to detect certain structural variants (SV) and tandem repeat expansions (TREs) due to short read lengths. In contrast, long-read sequencing (LRS) offers advantages by enabling the mapping of repetitive regions and resolving structural variations at nucleotide resolution, while also eliminating PCR bias. The paper emphasizes the role of transposable elements (TE) in the human genome and their potential to contribute to disease through various mechanisms. To address the diagnostic gap in IMD, the authors propose a novel approach that combines LRS targeted at specific loci with functional and metabolomic assays, leveraging metabolic profiling to enhance clinical utility.
Methods
In this study, fibroblasts were sourced from skin biopsies of participants, with the exception of participant P2, for whom a hepatic biopsy was utilized. The fibroblast cultures were sustained in Minimal Essential Medium (MEM) enriched with 10% fetal calf serum, 1% glutamine, and antibiotics (100,000 U/L penicillin and 100 mg/dL streptomycin). The cultures were incubated under controlled conditions, specifically at 37 °C in a humidified environment with 5% CO₂ to ensure optimal growth and viability of the cells.
Results
In this study, seven participants with clinical and/or biochemical indications of inborn metabolic disorders (IMDs) were evaluated. The potential diagnoses included combined oxidative phosphorylation deficiency (MIM#614946), glycogen storage diseases (MIM#240600/MIM#232400), peroxisome biogenesis disorder (MIM#214100), glucose transporter 1 deficiency syndrome (GLUT1-DS; MIM#606777), alpha-methylacetoacetic aciduria (MIM#203750), and medium-chain acyl-CoA dehydrogenase deficiency (MIM#201450). All conditions, except for GLUT1-DS, follow an autosomal recessive inheritance pattern.
Exome sequencing (ES) analysis revealed a heterozygous pathogenic variant in six participants, with five variants located in exonic regions and one in an intronic region, all associated with autosomal recessive inheritance. Notably, no pathogenic variants were identified in the participant suspected of having GLUT1-DS. While all identified variants were previously documented in the Human Gene Mutation Database (HGMD, 2025 v3), the variant ACAT1 NM_000019.4:c.841G>A was a novel finding. Despite these genetic analyses, the clinical cases remained unresolved.
Discussion
In this study, the authors employed a comprehensive approach integrating RNA studies, long-read sequencing (LRS), and functional genomics to investigate genetic variants associated with inherited metabolic disorders (IMDs). RNA extraction and analysis revealed significant transcriptional defects, including exon skipping and allele-specific expression (ASE) in several genes, such as FARS2, GYS2, AGL, and ACADM. Notably, the study identified novel variants, including tandem duplications and transposable element (TE) insertions, which were implicated in the observed aberrant splicing and reduced gene expression. The results suggest that TE insertions can disrupt gene regulation, highlighting their potential role as pathogenic factors in IMDs.
The LRS approach allowed for the detection of structural variants (SVs) and non-coding variants that would be missed by traditional short-read sequencing methods. The study demonstrated that these variants could significantly impact gene expression and splicing patterns, thereby contributing to disease phenotypes. Furthermore, the authors emphasized the importance of reevaluating existing genomic data to ensure that pathogenic variants are not overlooked, particularly in the context of autosomal recessive disorders. Overall, the findings underscore the utility of integrating multi-omics data to enhance the diagnostic accuracy for IMDs, revealing a broader spectrum of disease-causing variants and advocating for the incorporation of advanced sequencing technologies in clinical settings.