DOI: https://doi.org/10.1038/s41589-025-01929-w
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40542165
تاريخ النشر: 2025-06-20
المؤلف: Stephen Rettie وآخرون
الموضوع الرئيسي: تثبيط وتحليل البيبتيداز
مقدمة
توضح المقدمة المنهجية للتعبير غير المتجانس وتنقية مجال β-هيليكس من RbtA (بقايا A20-I459) في *E. coli*. تم تضخيم الجين الذي يشفر هذا المجال ودمجه مع علامة SNAC عند الطرف C، تلاه إدخاله في متجه pET-22b(+) باستخدام تجميع جيبسون. تم تأكيد التركيب من خلال التسلسل وتم تحويله إلى خلايا *E. coli* Rosetta (DE3). تم زراعة الخلايا، وتحفيزها باستخدام IPTG، ثم تم تحللها لاستخراج البروتين.
شملت عملية التنقية عدة خطوات، بما في ذلك استخدام عمود HisTrap HP والكروماتوغرافيا بالفصل حسب الحجم على عمود HiLoad 16/600 Superdex 200. تم تقييم نقاء البروتين عبر SDS-PAGE وصبغة كوماتسي. بالنسبة لعلم البلورات بالأشعة السينية، تمت إزالة علامة 6xHis الطرفية من خلال الانقسام الكيميائي، تلاه خطوات تنقية إضافية لضمان بروتين عالي الجودة مناسب للتحليل الهيكلي. تتيح هذه الطريقة الشاملة تقييم الروابط الماكروية وتحديد الهيكل بالأشعة السينية لـ RbtA.
مناقشة
في هذا القسم، يقدم المؤلفون RFpeptides، وهو خط أنابيب تعلم عميق (DL) مصمم لإنشاء روابط ماكروية جديدة تستهدف بروتينات متنوعة، بما في ذلك الخلايا النقوية اللوكيميا 1 (MCL1)، MDM2، بروتين مرتبط بمستقبل حمض γ-أمينوبوتيريك من النوع A (GABARAP)، وRhombotarget A (RbtA). تسلط الدراسة الضوء على التطبيق الناجح لـ RFpeptides في توليد هياكل ببتيد حلقي متنوعة وتحسين تسلسلات الأحماض الأمينية من خلال جولات متكررة من ProteinMPNN وRosetta Relax. يؤكد المؤلفون على أهمية استخدام طرق التصميم الموجه بالهيكل، والتي تتيح استكشافًا سريعًا للتنوع الكيميائي وتعزز من احتمالية تحقيق روابط عالية الألفة.
تظهر النتائج أن الماكروcycles المصممة تظهر ألفة ربط واعدة، مع أمثلة ملحوظة تشمل MCB_D2 لـ MCL1 (Kd = 2 µM) وMDB_D8 لـ MDM2 (Kd = 1.9 µM). أكدت البلورات بالأشعة السينية لهذه المجمعات أن الماكروcycles تتطابق عن كثب مع نماذج تصميمها، مما يثبت دقة خط أنابيب RFpeptides. علاوة على ذلك، نجحت الدراسة في تحديد روابط عالية الألفة ضد GABARAP وRbtA، مما يبرز قدرة الخط على تصميم روابط فعالة حتى للأهداف التي تفتقر إلى هياكل تم تحديدها تجريبيًا. بشكل عام، تؤكد النتائج على إمكانيات RFpeptides في تسهيل تطوير العلاجات الماكروية عبر مجموعة من الأهداف البروتينية الصعبة.
DOI: https://doi.org/10.1038/s41589-025-01929-w
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40542165
Publication Date: 2025-06-20
Author(s): Stephen Rettie et al.
Primary Topic: Peptidase Inhibition and Analysis
Introduction
The introduction details the methodology for the heterologous expression and purification of the β-helix domain of RbtA (residues A20-I459) in *E. coli*. The gene encoding this domain was amplified and fused with a SNAC tag at the C terminus, followed by insertion into a pET-22b(+) vector using Gibson assembly. The construct was confirmed through sequencing and transformed into *E. coli* Rosetta (DE3) cells. The cells were cultured, induced with IPTG, and subsequently lysed to extract the protein.
Purification involved several steps, including the use of a HisTrap HP column and size-exclusion chromatography on a HiLoad 16/600 Superdex 200 column. The purity of the protein was assessed via SDS-PAGE and Coomassie staining. For X-ray crystallography, the C-terminal 6xHis tag was removed through chemical cleavage, followed by further purification steps to ensure high-quality protein suitable for structural analysis. This comprehensive approach enables the evaluation of macrocyclic binders and the determination of the X-ray structure of RbtA.
Discussion
In this section, the authors present RFpeptides, a generative deep learning (DL) pipeline designed for the de novo creation of macrocyclic binders targeting various proteins, including myeloid cell leukemia 1 (MCL1), MDM2, γ-aminobutyric acid type A receptor-associated protein (GABARAP), and Rhombotarget A (RbtA). The study highlights the successful application of RFpeptides in generating diverse cyclic peptide backbones and optimizing their amino acid sequences through iterative rounds of ProteinMPNN and Rosetta Relax. The authors emphasize the importance of using structure-guided design methods, which enable rapid exploration of chemical diversity and enhance the likelihood of achieving high-affinity binders.
The results demonstrate that the designed macrocycles exhibit promising binding affinities, with notable examples including MCB_D2 for MCL1 (Kd = 2 µM) and MDB_D8 for MDM2 (Kd = 1.9 µM). The X-ray crystallography of these complexes confirmed that the macrocycles closely matched their design models, validating the accuracy of the RFpeptides pipeline. Furthermore, the study successfully identified high-affinity binders against GABARAP and RbtA, showcasing the pipeline’s capability to design effective binders even for targets lacking experimentally determined structures. Overall, the findings underscore the potential of RFpeptides to facilitate the development of macrocyclic therapeutics across a range of challenging protein targets.